EM - ESSEM - Biologia Molecular em Saúde
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- Infeções respiratórias por vírus influenza na Região Autónoma da Madeira : diagnóstico e epidemiologia da infeção por vírus pandémico 2009 Influenza A (H1N1)Publication . Dantas, Ana Filipa Fernandes; Pereira, José Miguel AzevedoA extensão mundial de doenças infeciosas que provocam morbilidade e mortalidade entre a população, deve-se em boa parte aos vírus, inclusivamente ao vírus Influenza A. A sua capacidade de diversidade genética leva ao surgimento de epidemias (drift antigénico) e de pandemias (shift antigénico). A história da humanidade vem sendo afetada com as principais pandemias provocadas pelo vírus Influenza A, nomeadamente: a “Gripe Espanhola” (H1N1) em 1918; a “Gripe Asiática” (H2N2) em 1957; “Gripe de Hong Kong” (H3N2) em 1968; a “Gripe Russa” (H1N1) em 1977; a “Gripe das Aves” (H5N1) em 1997 e por último a “Gripe Suína” (H1N1) em 2009. Surgindo no México, o vírus pandémico 2009 Influenza A (H1N1) resultou de um triplo reassortment, entre os segmentos de genes provenientes do vírus Influenza A: das aves Norte-americanas; dos humanos e dos suínos. A sua disseminação ocorreu em largo espetro, chegando a Portugal e consequentemente à Região Autónoma da Madeira. A presente dissertação, descreve o que ocorreu na Arquipélago da Madeira no ano de 2009 com a disseminação do vírus pandémico 2009 Influenza A (H1N1) entre a população residente e visitante. Foram analisadas de abril a dezembro desse ano, 1687 amostras de indivíduos com suspeita de infeção pelo vírus A(H1N1)pdm09, pela técnica de RT-qPCR. No total, o vírus provocou infeção a 691 (41,0%) indivíduos nativos e visitantes, levando à morte 10 (1,4%) residentes da região.
- Estudo da proteína humana centrossomal TBCCD1 em condições de stress oxidativo causado por H2O2 em estado estacionárioPublication . Calapez, Mariana de Amaral Figueira Guerreiro; Soares, Helena; Cyrne, LuísaNos últimos anos têm sido realizados inúmeros estudos sobre espécies reactivas de oxigénio (EROs), devido ao seu envolvimento em processos como o cancro e envelhecimento. Contudo, as EROs são subprodutos normais do metabolismo celular, podendo também ter origem em fontes exógenas à célula. As ERO, como o peróxido de hidrogénio (H2O2), são espécies muito instáveis e quimicamente bastante reactivas, com capacidade de causar vários danos graves nas diferentes biomoléculas. O H2O2 é in vivo um oxidante suave contudo, devido à sua permeabilidade através das membranas celulares tem sido alvo de grande interesse, estando implicado em processos de desencadeamento e modulação de vias de sinalização celulares. O interesse de estudar o H2O2 como um possível regulador de algumas proteínas centrossomais surgiu através de um estudo retrospectivo, em que foi verificada a associação entre altos níveis de H2O2, bolus addiction, e a hiperamplificação dos centrossomas e formação de fusos mitóticos multipolares. Posto isto, como consequência foi verificado um aumento de células multinucleadas, este que por sua vez está associado a vários processos patológicos. Face a estes resultados, propôs-se como hipótese que o H2O2 em baixas concentrações, semelhantes às encontradas fisiologicamente, poderia modelar os níveis de algumas proteínas centrossomais, como o TBCCD1 (de TBCC-domain containing protein 1), a γ-tubulina e a pericentrina. O TBCCD1 é um potencial regulador do posicionamento do centrossoma e por consequência da organização interna da célula. A γ-tubulina e a pericentrina desempenham funções específicas ao nível da nucleação dos microtúbulos. Neste estudo, foram usadas duas linhagens celulares (hTERT- RPE-1 e HeLa) as quais foram expostas, através do método de titulação de H2O2 em estado estacionário a uma concentração constante de 10 e 25μM de H2O2 , respectivamente, durante um determinado período de tempo. Os níveis das proteínas em estudo foram analisados por Western blotting. Como resultados, não foram identificadas alterações significativas nos níveis da proteína TBCCD1, em ambas as linhagens, e na γ-tubulina em h-TERT-RPE-1. No caso da pericentrina (hTERT- RPE-1 e HeLa), foi observada uma diminuição dos níveis proteicos, podendo estar relacionado com uma diminuição da capacidade nucleadora do centrossoma, uma vez que a pericentrina recruta os complexos γ- TuRC para esta estrutura.
- Purification of antimicrobial peptides secreted by Saccharomyces cerevisiae and proteomic analysis of cell membrane-associated proteinsPublication . Santos, Lara Andreia Brito dos; Almeida, Maria Gabriela Machado de; Albergaria, Maria Helena Whytton da Terra Soares deSaccharomyces cerevisiae secretes antimicrobial peptides (AMPs) during mixed culture fermentations that are derived from the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) enzyme and induce the early death of non-Saccharomyces yeasts. Considering the potential of AMPs to be used as natural preservatives in wine, the first aim of the present work was to produce and purify them in a preparative scale so that they could be applied in winery fermentations. Firstly, we produced 3 L of S. cerevisiae fermentation supernatants and subjected those to ion-exchange chromatography using a preparative DEAE-Sephadex column. One bioactive fraction, exhibiting a chromatographic profile similar to that exhibited by the previously found AMPs, was obtained. However, our work showed that the chromatographic system used was not fully efficient to purify the AMPs in a single step, requiring an additional size-exclusion chromatographic step. Several studies have shown that early death of non-Saccharomyces yeasts during wine fermentations is induced by S. cerevisiae through cell-cell contact and secretion of AMPs. Moreover, unpublished work showed that S. cerevisiae cells pre-grown for 48 h are able to induce death of Hanseniaspora guilliermondii by cell-cell contact, while 12 h-grown cells are not. Considering these findings and knowing that GAPDH is a cell wall-associated protein in S. cerevisiae, we hypothesized that these AMPs could be present in the membranes of S. cerevisiae and in this way induce death of non-Saccharomyces by cell-cell contact. The second aim of our work was to analyze membrane proteins of S. cerevisiae cells grown for 12 h and 48 h, using two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Proteomic analysis revealed the presence of two spots of molecular weight and isoelectric point similar to the previously found AMPs, which were differentially expressed in the two growth stages. The spots were analysed by mass spectrometry, confirming the presence of GAPDH-derived peptides. Thus, our work raised evidence that death of non-Saccharomyces yeasts by cell-cell contact might be due to the presence of GAPDH-derived AMPs in the membranes of S. cerevisiae cells. However, to definitively confirm this hypothesis further work is required.
- Associação do SNP A49G do gene CTLA4 à diabetes tipo 1 na população madeirensePublication . Carvalho, Inês da Silva Vieira Nunes de; Spínola, HélderA Diabetes Mellitus tipo 1 (DMT1) é uma desordem metabólica de etiologia múltipla, caracterizada pela destruição autoimune de células β das ilhotas de Langerhans pancreáticas. Não há cura para esta doença e as complicações a longo prazo podem causar incapacidade grave, diminuindo a esperança média de vida. A sua etiologia exata e patogénese ainda são desconhecidas. Com este estudo pretendeu-se verificar se o Single Nucleotide Polymorphism (SNP) A49G no gene CTLA4 está associado à suscetibilidade para o desenvolvimento da DMT1 na população madeirense. Para tal, através da técnica de Restriction Fragment Length Polymorphism caracterizaram-se 81 amostras de doentes e 98 de controlos para este polimorfismo, procedendo à sua análise estatística e incluindo dados previamente existentes para os genes HLA-DQA1, HLA-DQB1 e HLA-DRB1.
- A via de sinalização Notch no desenvolvimento da gónada embrionária de ratinhoPublication . Batista, Marta Sofia Serra; Trindade, Alexandre; Silva, Maria ElisabeteA via de sinalização Notch é um mecanismo molecular conservado em termos evolutivos que regula o destino celular em vários sistemas, tanto na embriogénese como na idade adulta. No sistema reprodutor adulto masculino e feminino, o envolvimento desta via encontra-se descrito em diversos processos mas a informação acerca desta via na gónada embrionária é escassa. Assim, este trabalho pretende aprofundar o conhecimento acerca do envolvimento desta via na gónada embrionária, tendo como objetivos analisar o padrão de expressão dos membros da via durante o desenvolvimento da gónada e avaliar a função do ligando Dll4 durante este processo. Para realizar a caracterização do padrão de expressão dos membros da via Notch no desenvolvimento da gónada foram utilizados murganhos da estirpe CD1. Para determinar a função in vivo do ligando Dll4 foi utilizada a linha de murganhos transgénicos Dll4 lox/lox CAG-Cre, sendo analisados os seguintes estádios de desenvolvimento: indução das fêmeas gestantes aos 9.75dpc e recolha dos embriões aos 11.5dpc; e indução das fêmeas aos 11.5dpc e recolha dos embriões aos 13.5dpc.
- Análise genotípica de estirpes de Mycobacterium tuberculosis oriundas da Guiné-BissauPublication . Sotero, Joana Mara Marques; Portugal, Isabel; Perdigão, JoãoA tuberculose (TB) representa actualmente um problema de saúde pública. A maioria dos casos, em 2013, ocorreu na Ásia e na Região Africana, particularmente na África Subsaariana, onde se detectaram na Guiné-Bissau 387 novos casos de TB por 100 000 habitantes. No mesmo ano detectaram-se em Portugal 26 novos casos por cada 100 000 habitantes. O presente estudo compreende a análise genotípica, através das técnicas de Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit – Variable Number of Tandem Repeat (MIRU-VNTR) e Spoligotyping de isolados clínicos oriundos da Guiné-Bissau e da Região de Saúde de Lisboa. Permitiu caracterizar e identificar estirpes de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) responsáveis por casos de TB na Guiné-Bissau e posicioná-las num contexto macroepidemiológico e comparar estirpes provenientes da Guiné-Bissau, com estirpes circulantes na Região de Saúde de Lisboa, incluindo a comparação com isolados de indivíduos nacionais da Guiné-Bissau. A caracterização e identificação de estirpes de M. tuberculosis responsáveis por casos de TB, na sua maioria resistentes, oriundos da Guiné-Bissau revelou uma maior incidência da linhagem Beijing e LAM9, e na Região de Lisboa as linhagens mais prevalentes foram a LAM4, T1 e Beijing.
- Análise do polimorfismo rs266882 no gene KLK3 por PCR-RFLP em casos de diagnóstico de adenocarcinoma da próstataPublication . Franco, Joana Sofia Cadilha; Silva, Alexandra Maia e; Ribeiro, Ana ClaraO adenocarcinoma da próstata é uma das neoplasias mais frequentes no género masculino em Portugal e a nível mundial. O antigénio específico prostático (PSA) tem sido utilizado como biomarcador para o rastreio de adenocarcinoma da próstata. No entanto, o aumento dos níveis de PSA não é específico da existência de uma neoplasia maligna, sendo observado em situações benignas. Torna-se urgente encontrar outros biomarcadores para o adenocarcinoma da próstata. Neste trabalho foi analisado o polimorfismo ARE-I do gene KLK3 na posição -158 em tecido prostático de indivíduos com diagnóstico de adenocarcinoma da próstata e indivíduos com hiperplasia benigna prostática provenientes do Serviço de Anatomia Patológica do CHBM. Foi utilizada a técnica de PCR-RFLP para análise do DNA extraído de cortes histológicos parafinados.
- Envolvimento de variantes genéticas específicas na suscetibilidade para o risco aumentado do cancro do cólon e reto e na agressividade tumoralPublication . Duarte, Marlene; Albuquerque, Cristina"O cancro do cólon e reto familiar do tipo X (FCCTX) define as famílias que preenchem os critérios de Amesterdão, nas quais não é identificada mutação germinal nos genes MMR e cujos tumores são microssatélites estáveis. A sua causa molecular permanece desconhecida. A maioria dos cancros do cólon e reto (CCR) são diagnosticados em fase avançada e mais de 50% desenvolvem metástases. Mutações em genes que codificam para componentes da via de sinalização WNT/B-catenina/TCF7L2 ocorrem na maioria dos CCR e conduzem à formação tumoral.
- Casuística da infeção por Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum/ Ureaplasma parvum e Mycoplasma hominis em amostras genitourinárias de utentes de um laboratório de análises clínicasPublication . Gonçalves, Tânia Vanessa Bernardo; Ferreira, Ana Paula; Cardoso, CarlosNeste estudo foram analisados os dados referentes às bactérias Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum, duma amostra constituída por 16 020 utentes de um laboratório de análises clínicas. Constatou-se que o maior número de pedidos de análises recaía sobre a Chlamydia trachomatis, dado esta ser uma das doenças sexualmente transmissíveis com maior prevalência atualmente, e que a faixa etária com maior pedido de análises se situa entre os 27 e os 34 anos, correspondendo a adultos sexualmente ativos e em idade reprodutiva. De salientar também a elevada incidência de infertilidade em Portugal e a ligação entre este facto e as doenças sexualmente transmissíveis. Verificou-se que do total das análises requeridas apenas 4,6% foram amostras do género masculino. No entanto, são os homens que apresentam globalmente uma maior taxa de positivos, estando este facto associado à existência de sintomatologia aquando do diagnóstico. Da análise da amostra em estudo conclui-se que as colheitas de urina e exsudado uretral são os produtos que apresentam maior positividade para ambos os sexos, no entanto, a colheita com maior número de pedidos é a de exsudado vaginal. Foi possível ainda verificar que os métodos moleculares que permitem a distinção entre ureaplasmas contribuem para o uso racional de antibióticos.
- Characterizing the function of two Drosophila Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptorsPublication . Casimiro, Andreia Palos; Gontijo, Álisson; Herédia, FabianaRelaxin is a hormone structurally similar to insulin, firstly described in 1926, as a substance with a significant influence on the reproductive system. While insulin activates a tyrosine kinase receptor and stimulates signaling pathway that includes phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and serine/threorine kinase (AKT), relaxins bind to Leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptors (LGRs) of the C1 subtype. In Drosophila, two LGRs of subtype C1 exhibit clear structural homology with relaxin receptors, described in mammals. Neverthless, the ligands and the biological functions of these receptors remain unknown not only in Drosophila, but also in invertebrates. Here our objective was to generate genetic tools to study the biological function of these two Type C1 LGRs in Drosophila. With this aim we generated mutant lines for both receptors through classical transposon remobilization techniques. The mutants obtained were characterized as strong loss-of-function deletions, yet no clear phenotype was observed for any of the receptors as regards viability and reproduction. We then tested the hypothesis that either Type C1 LGR could be part of the developmental delay pathway triggered by the Drosophila insuline-like peptide. This peptide is produced and secreted from abnormally growing imaginal discs and delays the onset of metamorphosis by inhibiting the biosynthesis of the major insect molting hormone ecdysone. Strikingly, we found that mutations in either Type C1 LGRs could suppress the insulin-like peptide-depend delay in the onset of metamorphosis to different extents. These results provide the first glimpse into a biological function for invertebrate Type C1 LGR receptors and place them downstream or in parallel to Drosophila insulin-like peptide in this developmental timing control pathway. The resemblance between human and Drosophila core physiological and developmental pathways reinforce that the fly can be a powerful model system to study genes and pathways that are relevant for human development and disease.
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