EM - ESSEM - Biologia Molecular em Saúde
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- Análise do polimorfismo rs266882 no gene KLK3 por PCR-RFLP em casos de diagnóstico de adenocarcinoma da próstataPublication . Franco, Joana Sofia Cadilha; Silva, Alexandra Maia e; Ribeiro, Ana ClaraO adenocarcinoma da próstata é uma das neoplasias mais frequentes no género masculino em Portugal e a nível mundial. O antigénio específico prostático (PSA) tem sido utilizado como biomarcador para o rastreio de adenocarcinoma da próstata. No entanto, o aumento dos níveis de PSA não é específico da existência de uma neoplasia maligna, sendo observado em situações benignas. Torna-se urgente encontrar outros biomarcadores para o adenocarcinoma da próstata. Neste trabalho foi analisado o polimorfismo ARE-I do gene KLK3 na posição -158 em tecido prostático de indivíduos com diagnóstico de adenocarcinoma da próstata e indivíduos com hiperplasia benigna prostática provenientes do Serviço de Anatomia Patológica do CHBM. Foi utilizada a técnica de PCR-RFLP para análise do DNA extraído de cortes histológicos parafinados.
- Análise genotípica de estirpes de Mycobacterium tuberculosis oriundas da Guiné-BissauPublication . Sotero, Joana Mara Marques; Portugal, Isabel; Perdigão, JoãoA tuberculose (TB) representa actualmente um problema de saúde pública. A maioria dos casos, em 2013, ocorreu na Ásia e na Região Africana, particularmente na África Subsaariana, onde se detectaram na Guiné-Bissau 387 novos casos de TB por 100 000 habitantes. No mesmo ano detectaram-se em Portugal 26 novos casos por cada 100 000 habitantes. O presente estudo compreende a análise genotípica, através das técnicas de Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit – Variable Number of Tandem Repeat (MIRU-VNTR) e Spoligotyping de isolados clínicos oriundos da Guiné-Bissau e da Região de Saúde de Lisboa. Permitiu caracterizar e identificar estirpes de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) responsáveis por casos de TB na Guiné-Bissau e posicioná-las num contexto macroepidemiológico e comparar estirpes provenientes da Guiné-Bissau, com estirpes circulantes na Região de Saúde de Lisboa, incluindo a comparação com isolados de indivíduos nacionais da Guiné-Bissau. A caracterização e identificação de estirpes de M. tuberculosis responsáveis por casos de TB, na sua maioria resistentes, oriundos da Guiné-Bissau revelou uma maior incidência da linhagem Beijing e LAM9, e na Região de Lisboa as linhagens mais prevalentes foram a LAM4, T1 e Beijing.
- Associação do SNP A49G do gene CTLA4 à diabetes tipo 1 na população madeirensePublication . Carvalho, Inês da Silva Vieira Nunes de; Spínola, HélderA Diabetes Mellitus tipo 1 (DMT1) é uma desordem metabólica de etiologia múltipla, caracterizada pela destruição autoimune de células β das ilhotas de Langerhans pancreáticas. Não há cura para esta doença e as complicações a longo prazo podem causar incapacidade grave, diminuindo a esperança média de vida. A sua etiologia exata e patogénese ainda são desconhecidas. Com este estudo pretendeu-se verificar se o Single Nucleotide Polymorphism (SNP) A49G no gene CTLA4 está associado à suscetibilidade para o desenvolvimento da DMT1 na população madeirense. Para tal, através da técnica de Restriction Fragment Length Polymorphism caracterizaram-se 81 amostras de doentes e 98 de controlos para este polimorfismo, procedendo à sua análise estatística e incluindo dados previamente existentes para os genes HLA-DQA1, HLA-DQB1 e HLA-DRB1.
- Caracterização imunohistoquímica e molecular de amostras de endométrio de cadela com piómetraPublication . Carvalho, Sandra Isabel Constantino Vieira de; Silva, Maria Elisabete Tomé Sousa; Mateus, Maria Luísa Freire LealA piómetra é uma doença de diestro comum em cadelas adultas, sendo Escherichia coli a bactéria mais frequentemente isolada. A resposta inflamatória é caracterizada pela produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas que contribuem para o recrutamento de células de reação inflamatória para o útero. Pretendeu-se com este estudo caracterizar o tipo e a localização das células de reação inflamatória em úteros com piómetra, bem como avaliar a transcrição de genes que codificam para componentes das vias de sinalização dos TLRs e de mediadores da inflamação, em comparação com úteros sem afeção de cadelas em diestro. Todos os casos de piómetra apresentaram um intenso infiltrado de células mielóides e linfócitos B e um infiltrado moderado de linfócitos T. Verificou-se que os transcritos dos componentes da via dependente e independente de MyD88 estão presentes no endométrio de cadelas com piómetra e de cadelas sem afeção uterina. Apenas os mRNAs das citocinas IL-1β e TNF-α, avaliados por RT-PCR, foram detetados exclusivamente nos casos de piómetra. A transcrição das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e IL-8 e anti-inflamatórias IL-10 e TGF-β, avaliada por PCR em tempo real, foi superior nas amostras de piómetra. Os transcritos da IL-2, IL-4, IFN-β e IFN-γ não foram detetados em ambos os grupos e os genes das metaloproteinases 1 e 9 apresentaram níveis de transcrição superiores nas amostras de endométrio de cadelas com piómetra.
- Casuística da infeção por Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum/ Ureaplasma parvum e Mycoplasma hominis em amostras genitourinárias de utentes de um laboratório de análises clínicasPublication . Gonçalves, Tânia Vanessa Bernardo; Ferreira, Ana Paula; Cardoso, CarlosNeste estudo foram analisados os dados referentes às bactérias Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum, duma amostra constituída por 16 020 utentes de um laboratório de análises clínicas. Constatou-se que o maior número de pedidos de análises recaía sobre a Chlamydia trachomatis, dado esta ser uma das doenças sexualmente transmissíveis com maior prevalência atualmente, e que a faixa etária com maior pedido de análises se situa entre os 27 e os 34 anos, correspondendo a adultos sexualmente ativos e em idade reprodutiva. De salientar também a elevada incidência de infertilidade em Portugal e a ligação entre este facto e as doenças sexualmente transmissíveis. Verificou-se que do total das análises requeridas apenas 4,6% foram amostras do género masculino. No entanto, são os homens que apresentam globalmente uma maior taxa de positivos, estando este facto associado à existência de sintomatologia aquando do diagnóstico. Da análise da amostra em estudo conclui-se que as colheitas de urina e exsudado uretral são os produtos que apresentam maior positividade para ambos os sexos, no entanto, a colheita com maior número de pedidos é a de exsudado vaginal. Foi possível ainda verificar que os métodos moleculares que permitem a distinção entre ureaplasmas contribuem para o uso racional de antibióticos.
- Characterizing the function of two Drosophila Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptorsPublication . Casimiro, Andreia Palos; Gontijo, Álisson; Herédia, FabianaRelaxin is a hormone structurally similar to insulin, firstly described in 1926, as a substance with a significant influence on the reproductive system. While insulin activates a tyrosine kinase receptor and stimulates signaling pathway that includes phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and serine/threorine kinase (AKT), relaxins bind to Leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptors (LGRs) of the C1 subtype. In Drosophila, two LGRs of subtype C1 exhibit clear structural homology with relaxin receptors, described in mammals. Neverthless, the ligands and the biological functions of these receptors remain unknown not only in Drosophila, but also in invertebrates. Here our objective was to generate genetic tools to study the biological function of these two Type C1 LGRs in Drosophila. With this aim we generated mutant lines for both receptors through classical transposon remobilization techniques. The mutants obtained were characterized as strong loss-of-function deletions, yet no clear phenotype was observed for any of the receptors as regards viability and reproduction. We then tested the hypothesis that either Type C1 LGR could be part of the developmental delay pathway triggered by the Drosophila insuline-like peptide. This peptide is produced and secreted from abnormally growing imaginal discs and delays the onset of metamorphosis by inhibiting the biosynthesis of the major insect molting hormone ecdysone. Strikingly, we found that mutations in either Type C1 LGRs could suppress the insulin-like peptide-depend delay in the onset of metamorphosis to different extents. These results provide the first glimpse into a biological function for invertebrate Type C1 LGR receptors and place them downstream or in parallel to Drosophila insulin-like peptide in this developmental timing control pathway. The resemblance between human and Drosophila core physiological and developmental pathways reinforce that the fly can be a powerful model system to study genes and pathways that are relevant for human development and disease.
- Construção do plasmídeo recombinante necessário à obtenção do "knockout" condicional da proteína Mob1 de Toxoplasma gondiiPublication . Ferreira, Andreia Filipa da Silva; Narciso, Sofia Bizarro Nolasco da SilvaO protozoário Toxoplasma gondii é um parasita intracelular obrigatório (filo Apicomplexa) que infeta vertebrados. Este parasita constitui uma preocupação séria de segurança sanitária dos alimentos e é um importante agente patogénico oportunista em doentes com SIDA e outros indivíduos imunossuprimidos. Durante a infeção, a resposta imunitária do hospedeiro induz a conversão deste parasita intracelular da sua forma proliferativa (taquizoítos) para a sua forma latente de quisto (bradizoítos). Os quistos de bradizoíto podem permanecer nos tecidos do hospedeiro durante toda a vida. Quando a imunidade do hospedeiro é atenuada os bradizoítos podem reconverter em taquizoítos que replicam ativamente, representando uma infeção crónica. A proteína Mob1 é uma excelente candidata a participante no controlo da replicação do parasita e consequentemente no estabelecimento da infeção. A Mob1 é essencial na citocinese e no controlo da proliferação cellular versus apoptose. A Mob1 humana, para além do envolvimento no controlo da proliferação também está envolvida na duplicação do centrossoma. Resultados obtidos pelo grupo onde me insiro demonstraram que a expressão do gene Mob1 em T.gondii diminui durante a replicação do parasita dentro das células hospedeiras, nomeadamente quarto horas após a invasão. Este periodo de tempo corresponde, de facto, ao início da replicação do parasita. Foi ainda criada uma estirpe de T. gondii a sobre-expressar Mob1 e analisado o fenótipo replicativo do parasita em resposta à sobre-expressão da Mob1. Os parasitas que sobre-expressavam Mob1 apresentavam um atraso na replicação comparativamente à estirpe selvagem. Estes resultados suportam a hipótese de que a Mob1 de T. gondii está envolvida no controlo da replicação do parasita e do número de parasitas dentro do hospedeiro. Com este trabalho pretendo construir um “knockout” condicional da Mob1 em T. gondii demonstrando qual o papel da proteína na replicação do parasita. Contudo não foi possível concluir, ficando por inserir na construção a 5’UTR e, posteriormente, o cDNA da Mob1.
- Envolvimento de variantes genéticas específicas na suscetibilidade para o risco aumentado do cancro do cólon e reto e na agressividade tumoralPublication . Duarte, Marlene; Albuquerque, Cristina"O cancro do cólon e reto familiar do tipo X (FCCTX) define as famílias que preenchem os critérios de Amesterdão, nas quais não é identificada mutação germinal nos genes MMR e cujos tumores são microssatélites estáveis. A sua causa molecular permanece desconhecida. A maioria dos cancros do cólon e reto (CCR) são diagnosticados em fase avançada e mais de 50% desenvolvem metástases. Mutações em genes que codificam para componentes da via de sinalização WNT/B-catenina/TCF7L2 ocorrem na maioria dos CCR e conduzem à formação tumoral.
- Estudo da proteína humana centrossomal TBCCD1 em condições de stress oxidativo causado por H2O2 em estado estacionárioPublication . Calapez, Mariana de Amaral Figueira Guerreiro; Soares, Helena; Cyrne, LuísaNos últimos anos têm sido realizados inúmeros estudos sobre espécies reactivas de oxigénio (EROs), devido ao seu envolvimento em processos como o cancro e envelhecimento. Contudo, as EROs são subprodutos normais do metabolismo celular, podendo também ter origem em fontes exógenas à célula. As ERO, como o peróxido de hidrogénio (H2O2), são espécies muito instáveis e quimicamente bastante reactivas, com capacidade de causar vários danos graves nas diferentes biomoléculas. O H2O2 é in vivo um oxidante suave contudo, devido à sua permeabilidade através das membranas celulares tem sido alvo de grande interesse, estando implicado em processos de desencadeamento e modulação de vias de sinalização celulares. O interesse de estudar o H2O2 como um possível regulador de algumas proteínas centrossomais surgiu através de um estudo retrospectivo, em que foi verificada a associação entre altos níveis de H2O2, bolus addiction, e a hiperamplificação dos centrossomas e formação de fusos mitóticos multipolares. Posto isto, como consequência foi verificado um aumento de células multinucleadas, este que por sua vez está associado a vários processos patológicos. Face a estes resultados, propôs-se como hipótese que o H2O2 em baixas concentrações, semelhantes às encontradas fisiologicamente, poderia modelar os níveis de algumas proteínas centrossomais, como o TBCCD1 (de TBCC-domain containing protein 1), a γ-tubulina e a pericentrina. O TBCCD1 é um potencial regulador do posicionamento do centrossoma e por consequência da organização interna da célula. A γ-tubulina e a pericentrina desempenham funções específicas ao nível da nucleação dos microtúbulos. Neste estudo, foram usadas duas linhagens celulares (hTERT- RPE-1 e HeLa) as quais foram expostas, através do método de titulação de H2O2 em estado estacionário a uma concentração constante de 10 e 25μM de H2O2 , respectivamente, durante um determinado período de tempo. Os níveis das proteínas em estudo foram analisados por Western blotting. Como resultados, não foram identificadas alterações significativas nos níveis da proteína TBCCD1, em ambas as linhagens, e na γ-tubulina em h-TERT-RPE-1. No caso da pericentrina (hTERT- RPE-1 e HeLa), foi observada uma diminuição dos níveis proteicos, podendo estar relacionado com uma diminuição da capacidade nucleadora do centrossoma, uma vez que a pericentrina recruta os complexos γ- TuRC para esta estrutura.
- Estudo de padrões de expressão de transcritos alternativos do gene tbccd1 em tecidos humanos e linhas celulares cancerígenasPublication . Câmara, Ana Isabel Rodrigues; Soares, Helena; Cyrne, LuísaO centrossoma é um organito essencial nos eucariotas sendo o principal centro organizador de microtúbulos nas células animais. É composto por um par de centríolos e rodeado por uma matriz pericentriolar. Em células em interfase, os centrossomas estão envolvidos na nucleação/organização dos microtúbulos, no posicionamento dos organitos, e.g. o complexo de Golgi, no estabelecimento da polaridade e ainda na migração e adesão, por sua vez em mitose facilitam a formação dos fusos mitóticos.
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