EM - ESSEM - Biologia Molecular em Saúde
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- Estudo dos genes AXIN2, BMPR1A e MGMT na susceptibilidade para o desenvolvimento de polipose serreadaPublication . Rocha, Melissa Mendes da; Albuquerque, CristinaA polipose serreada (PS) é uma doença rara caracterizada pela presença de pólipos no cólon, com uma histologia serreada (pólipos serreados) e associada a risco aumentado de desenvolvimento de cancro do cólon e recto (CCR). No entanto, as causas moleculares envolvidas na susceptibilidade para esta doença não são ainda conhecidas. Este trabalho teve como objectivo o estudo de genes candidatos para susceptibilidade para a PS – AXIN2, BMPR1A e MGMT, de forma a identificar causas moleculares que possam ser responsáveis por este síndrome. Com o estudo destes genes, pretendeu-se também contribuir para a caracterização das vias de tumorigénese envolvidas no mesmo. Com esta finalidade, foi efectuada a pesquisa de mutações germinais nestes genes em 12 indivíduos com PS. Para o BMPR1A foram ainda analisados 2 indivíduos com polipose juvenil. Foi também realizada a análise de perda de heterozigotia (LOH) do locus do gene MGMT em 47 lesões (pólipos serreados e adenomas tradicionais) de doentes com PS. Foram identificadas 21 mutações germinais: 14 no gene AXIN2, 5 no gene BMPR1A e 2 no gene MGMT. A análise in silico, utilizando os softwares SIFT, Polyphen, Human Splicing Finder, ESE Finder e Variant Effect Predictor (Ensembl), em alguns casos, conjugada com a análise de segregação da mutação com a doença nos familiares, permitiu a identificação de 5 mutações como possivelmente patogénicas: 2 no AXIN2 (c.1889G>A e c.2013_2024del12) e 3 no BMPR1A (c.430+1G>A, c.431-26T>A e c.676-6A>C), duas delas nos dois doentes com polipose juvenil. Foi detectada LOH do MGMT em 13/47 (28%) lesões de PS, sendo que todas apresentavam localização preferencial no cólon proximal/todo o cólon e 9 possuíam também metilação do gene MGMT. Em conclusão, não se pode excluir o envolvimento dos três genes estudados na susceptibilidade para a PS, sendo necessários estudos adicionais para confirmar a patogenicidade das mutações detectadas. Adicionalmente, para além da metilação do gene MGMT, verificou-se que a LOH é também um evento precoce que contribui para a iniciação tumoral no contexto de PS.
- Estudo da proteína humana centrossomal TBCCD1 em condições de stress oxidativo causado por H2O2 em estado estacionárioPublication . Calapez, Mariana de Amaral Figueira Guerreiro; Soares, Helena; Cyrne, LuísaNos últimos anos têm sido realizados inúmeros estudos sobre espécies reactivas de oxigénio (EROs), devido ao seu envolvimento em processos como o cancro e envelhecimento. Contudo, as EROs são subprodutos normais do metabolismo celular, podendo também ter origem em fontes exógenas à célula. As ERO, como o peróxido de hidrogénio (H2O2), são espécies muito instáveis e quimicamente bastante reactivas, com capacidade de causar vários danos graves nas diferentes biomoléculas. O H2O2 é in vivo um oxidante suave contudo, devido à sua permeabilidade através das membranas celulares tem sido alvo de grande interesse, estando implicado em processos de desencadeamento e modulação de vias de sinalização celulares. O interesse de estudar o H2O2 como um possível regulador de algumas proteínas centrossomais surgiu através de um estudo retrospectivo, em que foi verificada a associação entre altos níveis de H2O2, bolus addiction, e a hiperamplificação dos centrossomas e formação de fusos mitóticos multipolares. Posto isto, como consequência foi verificado um aumento de células multinucleadas, este que por sua vez está associado a vários processos patológicos. Face a estes resultados, propôs-se como hipótese que o H2O2 em baixas concentrações, semelhantes às encontradas fisiologicamente, poderia modelar os níveis de algumas proteínas centrossomais, como o TBCCD1 (de TBCC-domain containing protein 1), a γ-tubulina e a pericentrina. O TBCCD1 é um potencial regulador do posicionamento do centrossoma e por consequência da organização interna da célula. A γ-tubulina e a pericentrina desempenham funções específicas ao nível da nucleação dos microtúbulos. Neste estudo, foram usadas duas linhagens celulares (hTERT- RPE-1 e HeLa) as quais foram expostas, através do método de titulação de H2O2 em estado estacionário a uma concentração constante de 10 e 25μM de H2O2 , respectivamente, durante um determinado período de tempo. Os níveis das proteínas em estudo foram analisados por Western blotting. Como resultados, não foram identificadas alterações significativas nos níveis da proteína TBCCD1, em ambas as linhagens, e na γ-tubulina em h-TERT-RPE-1. No caso da pericentrina (hTERT- RPE-1 e HeLa), foi observada uma diminuição dos níveis proteicos, podendo estar relacionado com uma diminuição da capacidade nucleadora do centrossoma, uma vez que a pericentrina recruta os complexos γ- TuRC para esta estrutura.
- Estudo do DNA mitocondrial de um grupo de imigrantes oriundos de Cabo Verde residentes em Lisboa: contributo para o conhecimento da origem e evolução da população de um território integrado no ex-Império Colonial Português durante 500 anosPublication . Morais, Paulo Jorge Sampaio; Amorim, António; Costa, Heloísa AfonsoO DNA mitocondrial apresenta características particulares, tais como um elevado número de cópias por célula, herança uniparental materna, elevada taxa de mutação e ausência de recombinação, que permitem a sua utilização na clarificação da origem e evolução das populações humanas. O objetivo deste estudo foi obter informação sobre a origem, em termos genéticos, da população imigrante de Cabo Verde residente atualmente em Lisboa. Para tal procedeu-se à construção de uma base de dados de DNA mitocondrial de forma a caracterizar a diversidade genética de 103 imigrantes oriundos de Cabo Verde, residentes em Lisboa. A região controlo do DNA mitocondrial foi amplificada e sequenciada, entre as posições 16024 e 576, utilizando dois pares de primers (L15997/H016 e L1655/H599). As sequências obtidas foram inseridas na base de dados de DNA mitocondrial com maior relevância na área das Ciências Forenses, a EDNAP Forensic mtDNA Population Database - EMPOP. A análise da região controlo revelou elevada variabilidade genética, com elevada frequência de haplótipos únicos. A maioria das sequências de DNA mitocondrial corresponde a haplogrupos característicos de populações africanas. Uma pequena minoria corresponde a haplogrupos euroasiáticos. Os resultados obtidos são semelhantes aos resultados alcançados em estudos anteriores sobre a origem e evolução da população de Cabo Verde, o que sugere que a composição genética da população imigrante de Cabo Verde a residir atualmente em Lisboa é representativa da composição genética do arquipélago. Os resultados obtidos não contradizem a versão histórica da colonização do arquipélago de Cabo Verde, segundo a qual a referida colonização envolveu escravas africanas e indivíduos portugueses do sexo masculino, mobilizados à altura para a ex-colónia.
- Piso dos parques infantis como fonte de contaminação microbianaPublication . Fernandes, Ana Cláudia Cordeiro; Barroso, HelenaOs parques infantis são locais de diversão integrados na sociedade, servem a população infantil, e são considerados no geral como locais seguros. A maior preocupação centra-se sempre na correcta utilização dos equipamentos disponíveis de modo a evitar acidentes, e na realidade o perigo está menos visível. Este estudo foca o piso dos parques infantis como fonte de contaminação microbiana. Este estudo teve como objectivo quantificar a presença de microrganismo patogénicos para os humanos, analisando amostras do solo de 6 parques infantis da cidade de Lisboa, e relacionar os resultados obtidos com as condições climatéricas registadas no período de tempo compreendido entre Dezembro de 2010 e Agosto de 2011. No global de todos os parques os resultados revelam a presença de microrganismos patogénicos em valores muito elevados, sendo que os mais frequentes são Escherichia coli, Enterococos fecais e fungos. Assume-se que a presença destes microrganismos se deva ao facto de os parques serem espaços abertos, passiveis de contaminação proveniente da flora e fauna existente nas imediações, uma vez que na sua maioria as instalações dispõem de barreiras físicas ineficientes, permitindo o acesso a animais como cães, gatos, pequenos roedores e répteis. As bactérias isoladas, provenientes das amostras, foram sujeitas a análises microbianas e foi identificada a presença de resistência a antibióticos. Em todas as 18 colheitas realizadas se encontraram isolados com estas características. Para determinar o mecanismo de resistência presente em Escherichia coli, isolada neste estudo, foram seleccionadas 8 amostras que quando analisadas por meio de sequenciação, revelaram ser portadoras do gene EampC, que confere à bactéria resistência aos antibióticos β-lactâmicos.
- Identificação genética humana: estudos de novos marcadores genéticos do tipo STR e InDelPublication . Matos, Sara Mulenas Sá de; Amorim, António; Silva, ClaúdiaOs marcadores genéticos do tipo Short Tandem Repeats (STR), são os atualmente recomendados para a obtenção de perfis genéticos, sendo que, muito recentemente foi apresentado como obrigatório para uso forense, um novo conjunto destes marcadores. Não obstante, existem também outros tipos de marcadores genéticos passíveis de utilização para definir perfis genéticos, designadamente marcadores do tipo Inserção/Deleção, ou InDel. Os novos marcadores STR e a grande maioria dos marcadores InDel ainda não estão suficientemente estudados e implementados nos laboratórios forenses, pelo que é necessário validar a reação, calcular frequências alélicas, parâmetros estatísticos populacionais e forenses. Estudámos os novos marcadores STR e um conjunto de marcadores do tipo InDel numa amostra com cerca de 120 indivíduos do sul de Portugal, intervenientes em perícias médico-legais a decorrer no Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses. No que concerne aos marcadores STR incluídos no kit PowerPlex®ESI17 (promega), os ensaios de validação demonstraram a sua elevada sensibilidade, precisão e capacidade de detetar misturas de DNA. No entanto, relativamente aos limiares analíticos não está de acordo com o descrito anteriormente. Os parâmetros estatísticos populacionais e forenses estão de acordo com o esperado e o cálculo das distâncias genéticas demonstrou existir diferenças genéticas entre as populações em estudo. Relativamente aos marcadores do tipo InDel incluídos no kit Investigator DIPPlex® (Qiagen), os ensaios de validação demonstraram que o kit tem uma elevada sensibilidade, limiares analíticos relativamente baixos, boa capacidade de detetar misturas e boa precisão. As frequências alélicas estão em equilíbrio Hardy-Weinberg, no entanto os valores de heterozigotia não são os esperados. Os parâmetros estatísticos forenses estão de acordo com o esperado e o cálculo das 4 distâncias genéticas demonstrou que existem diferenças genéticas significativas relativamente a outras populações. Concluímos que ambos os kits poderão ser utilizados para a prática forense apesar de, aparentemente, não preencherem todos os requisitos habitualmente avançados para os marcadores genéticos a utilizar na rotina forense. Deverão ser realizados mais estudos com maior número de indivíduos e de diferentes populações.
- Estudo do papel da Catanina, na remodelação do citoesqueleto de microtúbulos, durante a invasão e a replicação do parasita toxoplasma gondiiPublication . Simões, Andreia Filipa Dâmaso; Nolasco, SofiaO Toxoplasma gondii (T.gondii) é um parasita intracelular protozoário pertencente ao filo Apicomplexa, é responsável pela toxoplasmose, a causa mais comum de deficiências neurológicas congénitas em humanos. Deste filo fazem parte membros como o Plasmodium falciparum o agente etiológico da malária em humanos, Besnoitia babesia e Theileria, parasitas que invadem animais de quinta como o gado. Os mecanismos de invasão deste protozoário ainda não estão bem esclarecidos, sabendo-se que o seu citoesqueleto desempenha um papel importante durante a sua invasão na célula hospedeira. Os mecanismos moleculares adjacentes ao processo de invasão das células hospedeiras parecem ser conservados entre os parasitas deste filo. Os microtúbulos são os principais constituintes do citoesqueleto celular. São regulados por três tipos de proteínas: as estabilizadoras, as motoras e as desestabilizadoras. A proteína em estudo é uma proteína desestabilizadora dos microtubulos, a catanina (subunidade catalítica p60). A catanina atua nos microtúbulos de uma forma específica, exercendo a sua função preferencialmente em microtúbulos com modificações pós-traducionais (PTMs), impedindo que estas se acumulem nos microtúbulos, como é o caso da glutamilação e da acetilação da tubulina. Os microtúbulos constituintes do citoesqueleto do protozoário em estudo são ricos em PTMs e estas parecem estar relacionadas com a grande estabilidade destas estruturas. Uma vez que estes microtúbulos altamente modificados são remodelados durante o processo de invasão por T. gondii, propomos estudar o papel da catanina durante este processo. Desta forma, clonámos o cDNA da catanina em fusão com a proteína GFP e com um domínio desestabilizador que permite controlar os níveis de expressão dentro da célula. Essa construção foi inserida dentro de T. gondii por eletroporação, com o objetivo de avaliar o efeito da sobre-expressão da catanina. A construção de DNA foi integrada com sucesso no genoma de T. gondii e a proteína de fusão foi produzida. Apesar de ainda ser necessário analisar se esta proteína apresenta o tamanho correto e se está funcional, numa primeira abordagem, os parasitas a sobre-expressar a catanina foram capazes de invadir a célula hospedeira e não se observou danos nos microtúbulos glutamilados. De qualquer forma, estes resultados são preliminares e ainda é necessário prosseguir com a caracterização da função da catanina de T. gondii.
- Estudo de padrões de expressão de transcritos alternativos do gene tbccd1 em tecidos humanos e linhas celulares cancerígenasPublication . Câmara, Ana Isabel Rodrigues; Soares, Helena; Cyrne, LuísaO centrossoma é um organito essencial nos eucariotas sendo o principal centro organizador de microtúbulos nas células animais. É composto por um par de centríolos e rodeado por uma matriz pericentriolar. Em células em interfase, os centrossomas estão envolvidos na nucleação/organização dos microtúbulos, no posicionamento dos organitos, e.g. o complexo de Golgi, no estabelecimento da polaridade e ainda na migração e adesão, por sua vez em mitose facilitam a formação dos fusos mitóticos.
- Estudos histoquímicos e genéticos sobre a Medusa Catostylus Tagi: (I) caracterização morfológica e histoquímica de componentes estruturais dos nematocistos; (II) Comparação das regiões 18S, 28S e ITS1 do rDNA de exemplares do Tejo e SadoPublication . Parracho, Tiago da Cunha Tomé; Morais, Zilda"No presente trabalho, estudaram-se aspectos morfológicos, histoquímicos e moleculares da medusa Catostylus tagi. As abordagens morfológica e histoquímica focalizaram-se nos nematocistos do animal. Através da análise por microscopia óptica e electrónica de varrimento, determinaram-se parâmetros em variedades de isorhizas e euryteles. Utilizando colorações histoquímicas constatou-se que as proteínas NOWA e “spinalin”, detectadas em Hydras, podem estar presentes na C. tagi, a primeira na membrana exterior da cápsula e a segunda integrando o mecanismo de ejecção. Ainda em relação às macromoléculas, verificou-se que a membrana da cápsula pode conter mucinas ácidas, com polissacáridos semelhantes à quitina, enquanto os componentes azotados, distribuídos no interior do nematocisto, assemelham-se a materiais colagénicos. Pela ausência de cobre, foi descartada a ocorrência de proteínas antioxidantes do tipo superóxido dismutase. Em relação ao cálcio, observou-se a sua presença na membrana envolvente dos nematocistos e no sistema contráctil, provavelmente complexado com as macromoléculas aniónicas. A propósito das relações genéticas, compararam-se exemplares de Catostylus que ocorrem nos estuários do Tejo e do Sado, e estes com outras três medusas, nomeadamente Catostylus mosaicus, Cyanea capillata e Aurelia aurita, através das sequenciações parciais dos genes que codificam para os RNAs ribossomal 18S e 28S, além da sequenciação total do espaçador interno transcrito 1 (ITS1). A análise cladística, baseada no método da máxima verosimilhança, confirmou os resultados macroscópicos que indicam que os exemplares do Sado e Tejo pertencem à mesma espécie, denominada C. tagi. Na comparação da C. tagi com as outras medusas, comprovou-se a sua relação monofilética com a C.mosaicus e parafilética com a C. capillata e a A. aurita. Os resultados deste estudo elucidaram, pela primeira vez, a tipologia e a composição química parcial dos nematocistos da C.tagi, e comprovaram que a recolha para análise pode ser feita indistintamente no Sado ou no Tejo."
- Implementação de um método de validação do controlo de qualidade em amostras de DNA armazenadas no Biobanco-IMMPublication . Silva, Vanessa Gonçalves; Caetano-Lopes, JoanaNo Biobanco-IMM as amostras são colhidas e armazenadas por longos períodos de tempo sendo de extrema importância que estas sejam de elevada qualidade. Para cumprir este requisito, os procedimentos do biobanco efetuam-se de acordo com diretrizes internacionais para a avaliação da qualidade das amostras que armazena.
- Caracterização imunohistoquímica e molecular de amostras de endométrio de cadela com piómetraPublication . Carvalho, Sandra Isabel Constantino Vieira de; Silva, Maria Elisabete Tomé Sousa; Mateus, Maria Luísa Freire LealA piómetra é uma doença de diestro comum em cadelas adultas, sendo Escherichia coli a bactéria mais frequentemente isolada. A resposta inflamatória é caracterizada pela produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas que contribuem para o recrutamento de células de reação inflamatória para o útero. Pretendeu-se com este estudo caracterizar o tipo e a localização das células de reação inflamatória em úteros com piómetra, bem como avaliar a transcrição de genes que codificam para componentes das vias de sinalização dos TLRs e de mediadores da inflamação, em comparação com úteros sem afeção de cadelas em diestro. Todos os casos de piómetra apresentaram um intenso infiltrado de células mielóides e linfócitos B e um infiltrado moderado de linfócitos T. Verificou-se que os transcritos dos componentes da via dependente e independente de MyD88 estão presentes no endométrio de cadelas com piómetra e de cadelas sem afeção uterina. Apenas os mRNAs das citocinas IL-1β e TNF-α, avaliados por RT-PCR, foram detetados exclusivamente nos casos de piómetra. A transcrição das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e IL-8 e anti-inflamatórias IL-10 e TGF-β, avaliada por PCR em tempo real, foi superior nas amostras de piómetra. Os transcritos da IL-2, IL-4, IFN-β e IFN-γ não foram detetados em ambos os grupos e os genes das metaloproteinases 1 e 9 apresentaram níveis de transcrição superiores nas amostras de endométrio de cadelas com piómetra.
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