INMLCF - Comunicações Científicas e Pósteres
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- Drop-outs alélicos: implicações nas perícias médico-legaisPublication . Franco, Magda; Correia Dias, Helena; Coimbra Serra, Armando; São Bento, Marta; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO perfil genético de um indivíduo constitui uma ”impressão digital” genética, sendo obtido através da análise de regiões específicas do ADN que apresentam elevada variabilidade entre indivíduos. No Serviço de Genética e Biologia Forenses do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, o perfil genético é determinado com recurso à análise de marcadores constituídos por sequências curtas e repetitivas de ADN designadas por Short Tandem Repeats (STR). O processamento laboratorial dos casos periciais é realizado por dois peritos distintos, de forma independente, e compreende as etapas de extração de ADN, amplificação por PCR e análise de fragmentos. Para a amplificação são usados dois kits diferentes: o GlobalFiler e o PowerPlex Fusion 6C, que permitem a análise de 24 e 28 marcadores STR, respetivamente. Estes kits partilham vários marcadores e, quando aplicados à mesma amostra, é expectável que os alelos coincidam, permitindo assim confirmar a identidade do indivíduo e aumentar a robustez dos resultados periciais. O presente trabalho tem como objetivo apresentar dois casos em que se observaram discrepâncias nos perfis genéticos obtidos com os dois kits referidos, nomeadamente nos marcadores D12S391 e D18S51, nas mesmas amostras de referência. No caso 1, no marcador D12S391, apenas foi detetado o alelo 17 na amplificação com o kit GlobalFiler, enquanto que com o kit PowerPlex Fusion 6C foram detetados os alelos 17 e 20. No caso 2, no marcador D18S51, ocorreu uma situação similar em que na amplificação com o kit Globalfiler foi detetado apenas o alelo 13, enquanto que com o kit PowerPlex Fusion 6C foram detetados os alelos 12 e 13. Importa referir que ambos os casos se referem a amostras de referência, e que as amplificações foram repetidas com os dois kits com o objetivo de confirmar os perfis genéticos previamente obtidos. As discrepâncias observadas poderão ser justificadas pela ocorrência de mutações nos locais de annealing dos primers do kit GlobalFiler, conduzindo a fenómenos de allelic drop-out e, consequentemente, à não deteção de determinados alelos. Estes casos refletem algumas das dificuldades enfrentadas na rotina laboratorial forense, sendo que são de maior relevância quando se trata de amostras problema tanto de casos criminais, como de casos de identificação individual, podendo ter implicações significativas na interpretação dos resultados. Acresce que, a introdução na base de dados de apenas o perfil obtido com um dos kits (e.g., GlobalFiler) poderia resultar em ocorrência de hits incompletos, comprometendo a eficácia das buscas. Em suma, torna-se fundamental que o perito adote uma abordagem crítica e minuciosa na avaliação de cada caso, promovendo a validação cruzada dos perfis genéticos obtidos com diferentes sistemas multiplex. Idealmente, devem ser analisadas duas amostras biológicas distintas do mesmo indivíduo (e.g., sangue e saliva) com ambos os kits, reforçando a confiança e fiabilidade dos resultados obtidos.
- Estudos sobre o ADN mitocondrial de imigrantes de Angola integrados na população de Lisboa: uma contribuição com interesse biogeográfico e forensePublication . Lago, Iris; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Rebelo, Maria Teresa; Amorim, AntónioO ADN mitocondrial (mtDNA) é um constituinte da mitocôndria, que se encontra no citoplasma da célula. O mtDNA tem sido alvo de estudo para aplicação em áreas das ciências forenses e em estudos populacionais, devido às suas características únicas. Quando comparado com o ADN nuclear, o mtDNA apresenta origem uniparental (herdado exclusivamente da mãe), ausência de recombinação e elevado número de cópias. Estas caraterísticas tornam o mtDNA no candidato ideal para estudos de amostras antigas ou degradadas, nas quais o ADN nuclear revela-se insuficiente ou inconclusivo. O mtDNA é composto pela zona codificante e zona não codificante (ou região controlo), sendo esta última o alvo da maioria das investigações. No entanto, com novos avanços tecnológicos foram criadas técnicas que permitem analisar o genoma mitocondrial completo, como as tecnologias de Next Generation Sequencing (NGS). Quando comparado com outras técnicas que analisam apenas a região controlo, como Sanger, a NGS permite definir haplótipos e haplogrupos de maior resolução. A imigração em Portugal tem aumentado e a população angolana integrada em Lisboa é uma das que mais se destaca no país. O estudo da mesma é essencial para auxiliar a compreensão do genoma destes indivíduos, bem como do genoma associado à população angolana. Para além disso, é uma das populações que ainda não foi estudada com recurso a novas tecnologias de nova geração. Angola situa-se no sudoeste africano, onde prevalecem algumas ramificações do haplogrupo L, porém, dada a miscigenação existente em África, também se encontram outros haplogrupos oriundos de outras partes do mundo. Neste trabalho foram utilizadas amostras de sangue (n=170) de indivíduos angolanos residentes em Lisboa, que apresentem ascendência materna angolana. Após a extração de ADN e da quantificação do mesmo, realizou-se a sequenciação do mtDNA com a técnica NGS. O genoma mitocondrial completo foi analisado de maneira a determinar os haplótipos de cada indivíduo e os seus haplogrupos. Ao adicionar esta informação à base de dados EMPOP, o conhecimento sobre esta população e mtDNA aumenta. Este trabalho permite concluir, como esperado, que os indivíduos da população angolana apresentam principalmente haplogrupos L, como L0, L1, L2 e L3. Por outro lado, estes dados contribuem para a determinação de parâmetros sobre a população estudada, como diversidade sequencial, a diversidade nucleotídica e uma análise interpopulacional, bem como a construção de uma árvore filogenética.
- Resolução de discrepâncias alélicas em marcadores STR através de tecnologias de sequenciação de nova geração (NGS)Publication . Nascimento, Rui; Afonso Costa, Heloísa; Amorim, AntónioA tipagem de microssatélites (STRs) constitui um pilar da genética forense, baseando-se na inferência dos alelos através do tamanho dos fragmentos de DNA obtido por eletroforese capilar. No entanto, a obtenção de perfis genéticos discrepantes, para um mesmo marcador STR, entre diferentes kits comerciais levanta dúvidas quanto à veracidade dos resultados. Neste trabalho, apresentamos o caso de estudo de uma amostra forense que exibiu resultados discrepantes para o locus D2S1338. Com o kit GlobalFiler foi obtido o perfil genético 18.2, 23 enquanto que com o kit PowerPlexFusion6C foi determinado o perfil genético 18, 23. Tendo em conta a ausência de evidência de drop in alélico, e após reanálise dos resultados, tornou se imprescindível recorrer a uma abordagem que permitisse a leitura direta da sequência, e não apenas a inferência pelo tamanho. Para tal, recorreu-se à sequenciação da amostra por tecnologias de NGS, onde é possível efetuar uma sequenciação efetiva dos fragmentos, por oposição à eletroforese capilar onde é analisado apenas o tamanho do fragmento. Para o procedimento de NGS, procedeu se à extração de DNA segundo protocolos validados, seguida da construção de bibliotecas com o painel Precision ID GlobalFiler™ NGS STR Panel v2. A preparação das bibliotecas e carregamento do chip foi feita de forma automática na plataforma Ion Chef, e a sequenciação foi feita com recurso à plataforma Ion GeneStudio™ S5 System. A análise primária foi realizada no Torrent Suite™, com alinhamento das sequências ao genoma de referência (hg19). A análise secundária foi feita com recurso ao software Converge™. Os resultados de NGS confirmaram a presença efetiva dos alelos 18 e 23 no locus D2S1338, explicando a discrepância observada entre os dois kits comerciais e validando o verdadeiro resultado para este marcador. A discrepância entre os resultados obtidos pelos kits utilizados na eletroforese capilar deveu-se a uma mutação InDel, na zona intercalar entre a zona de ligação dos primers e o marcador STR. Uma mutação deste tipo altera o tamanho final do amplicão que irá ser observado por eletroforese capilar, obtendo-se assim um perfil genético incorreto para este marcador. Este caso de estudo sublinha a importância da integração da tecnologia NGS como ferramenta complementar na prática forense, especialmente em situações de perfis genéticos discrepantes ou amostras degradadas. A sequenciação direta dos STRs torna a tipagem genética mais robusta e reduz ambiguidades. Esta abordagem reforça a fiabilidade dos resultados, tanto em investigações criminais como na validação de perfis em bases de dados forenses.
- Valorização estatística da prova, análise qualitativa em contraponto à análise quantitativa - a propósito de um casoPublication . Vieira da Silva, Cláudia; Amorim, António; Carvalho, Mónica
- Validação do investigator Argus Y-28 QS(Qiagen) - estudo comparativo em amostras de referênciaPublication . Costa, Henrique; Afonso Costa, Heloísa; Amorim, António; Vieira da Silva, Cláudia
- Vigilância do SARS-CoV-2 em cadáveres sujeitos a autópsia médico-legal em PortugalPublication . Shastakova, Alena; Fadoni, Jennifer; DE SOUSA MAGALHÃES, JÉSSICA; Cerqueira, Joana; Balsa, Filipa; Franco, Magda; Mofreita, Vânia; Correia Dias, Maria Helena; Cainé, Laura; Amorim, AntónioA microbiologia forense desempenha um papel essencial no diagnóstico de causas infeciosas de mortes súbitas ou inexplicadas. Com a pandemia de COVID-19, tornou-se evidente a necessidade de estudos post-mortem para aprofundar o conhecimento sobre a epidemiologia viral, com especial enfoque no SARS-CoV-2. Ao contrário de outros vírus respiratórios, o SARS-CoV-2 não apresenta um padrão estritamente sazonal, embora flutuações nos casos sugiram ondas intermitentes de transmissão, influenciadas pelos níveis de imunidade adquirida e pelo comportamento humano. O vírus apresenta um amplo espectro clínico, desde casos assintomáticos até pneumonia grave e síndrome de desconforto respiratório agudo. O objetivo desse trabalho foi determinar a prevalência do SARS-CoV-2 em zaragatoas nasofaríngeas colhidas post-mortem, antes da execução autópsias forenses realizadas entre abril de 2024 e abril de 2025. No total, foram testadas 1223 amostras para SARS-CoV-2. Antes do processamento, as amostras permaneceram em banho seco a 56 °C durante 30 minutos para a inativação de possíveis patógenos. O RNA foi extraído por via automatizada com o kit EZ1 DSP Virus (QIAGEN) e por extração térmica — aquecimento a 100 °C durante 8 minutos. A reação de PCR em tempo real teve como alvo os genes N1 e E do vírus e o gene humano RPP30/RNase P como controlo interno de fiabilidade. Foram utilizadas sondas marcadas com fluoróforos para deteção dessas regiões genómicas. Valores de Ct inferiores a 35 foram considerados positivos, amostras com Ct entre 35 e 40 foram re-analisadas. Das 1223 amostras testadas, 22 (1,8%) foram positivas para SARS-CoV-2, com idades dos indivíduos a variar entre os 21 e os 98 anos. Distribuição mensal dos casos positivos: abril - 0, maio - 1, junho - 3, julho - 4, agosto - 5, setembro - 3, outubro - 4, novembro - 0, dezembro – 2, janeiro - 1, fevereiro - 0, março - 0. A taxa de deteção de 1,8% de SARS-CoV-2 destaca o impacto contínuo na saúde pública. A ampla faixa etária dos casos demonstra a sua persistente transmissibilidade. A vigilância post-mortem permite identificar casos não diagnosticados em vida, contribuindo para uma melhor compreensão da circulação viral e para a definição de políticas de saúde pública. O rastreio forense reforça as medidas de segurança dos profissionais envolvidos em autópsias e apoia estratégias de gestão de surtos baseadas em evidência. A vigilância post-mortem constitui uma ferramenta essencial para acompanhar a prevalência do SARS-CoV-2. As taxas de deteção observadas neste estudo evidenciam o impacto do vírus em Portugal entre abril de 2024 e abril de 2025. A integração da microbiologia forense na vigilância epidemiológica fortalece a monitorização viral, melhora a preparação em saúde pública e apoia decisões informadas na gestão de surtos.
- A importância dos Y-STRs com taxa de mutação rápida (RM-YSTRs) na resolução de casos forenses- a propósito de um casoPublication . Vieira da Silva, Cláudia; Amorim, António; Carvalho, Mónica; .
- Infeções Sexualmente Transmissíveis: deteção molecular de microrganismos em amostras colhidas no âmbito de crimes sexuaisPublication . Eira, Ana; Correia Dias, Maria Helena; Franco, Magda; Fadoni, Jennifer; Amorim, António; Cainé, LauraIntrodução: Os crimes sexuais constituem um dos maiores desafios da Medicina Legal, tanto pela complexidade técnico-científica envolvida como pela sensibilidade das situações. Na maioria dos casos, as análises forenses concentram-se na identificação genética do agressor. Contudo, a deteção de infeções sexualmente transmissíveis (ISTs) nas amostras biológicas recolhidas pode fornecer evidência complementar de elevado valor probatório, permitindo sustentar a existência de contacto sexual e, simultaneamente, assegurar o adequado encaminhamento clínico da vítima. O presente estudo teve como objetivo aplicar a técnica de PCR em tempo real (RT-PCR) para a deteção de microrganismos responsáveis por ISTs, a partir de amostras colhidas a vítimas de agressão sexual. Material e métodos: Analisaram-se 231 amostras biológicas (zaragatoas vaginais, retais e orais) colhidas entre 2004 e 2017 e armazenadas a -20ºC. A deteção e amplificação do material genético foi realizada através de RT-PCR, utilizando primers específicos para os principais agentes etiológicos de ISTs: Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis e Treponema pallidium. Resultados e discussão: Foram detetados 11 casos positivos para Chlamydia trachomatis e 13 para Trichomonas vaginalis. A técnica de RT-PCR revelou-se útil na deteção de DNA de microrganismos responsáveis por ISTs mesmo em amostras antigas e degradadas. A robustez desta técnica é pode ser especialmente útil quando a evidência biológica disponível é escassa ou comprometida. A ausência de deteção de Neisseria gonorrhoeae e Treponema pallidium poderá dever-se à sua menor prevalência na população estudada ou a limitações associadas à degradação das amostras, devido ao tempo de armazenamento e também ao facto de nem todos os microrganismos, mesmo existindo a IST, terem uma distribuição e/ou localização com igual padrão. Os resultados confirmam a utilidade das metodologias moleculares na deteção de microrganismos responsáveis por ISTs como complemento à identificação genética humana, contribuindo para caracterizar o tipo de contacto sexual e apoiar o encaminhamento clínico da vítima. A deteção de ISTs pode ainda constituir prova adicional com relevância jurídica, sobretudo em casos com transmissão comprovada. A aplicação eficaz da técnica a diferentes tipos de amostras (vaginais, retais e orais) reforça o seu valor no em contexto forense. Conclusão: A técnica de RT-PCR demonstrou ser uma ferramenta valiosa na análise de amostras forenses no âmbito de crimes sexuais, contribuindo para a o encaminhamento da vítima. A sua integração nos protocolos forenses para crimes sexuais deve ser considerada uma mais-valia.
- População do Norte de Portugal: estudo da diversidade genética e parâmetros forenses de 26 marcadores Y-STRPublication . Maia, Bárbara; Fadoni, Jennifer; Souto, Luís; Amorim, AntónioIntrodução O cromossoma Y existe como cópia única nos homens e é herdado de pai para filho, logo, salvo mutação, todos os homens de uma linhagem paterna partilham um cromossoma Y idêntico com o mesmo haplótipo. É uma ferramenta poderosa para estudar populações humanas e caminhos evolutivos, pois a sua porção não recombinante regista os eventos mutacionais que ocorreram nas linhagens masculinas ao longo da evolução. Os objetivos deste estudo foram realizar a análise do ADN do cromossoma Y de indivíduos da população do Norte de Portugal, bem como determinar os seus haplótipos, contribuindo para a informação genética descrita na base de dados YHRD, e inferir os haplogrupos correspondentes. Materiais e Métodos Foram analisadas 252 amostras (21 zaragatoas bucais e 231 manchas de sangue) provenientes de indivíduos do sexo masculino residentes na região norte de Portugal, recolhidas de 2021 a 2023 e disponíveis no INMLCF, I.P. As zaragatoas foram submetidas ao processo de extração automatizada previamente à amplificação, e as manchas de sangue foram processadas por amplificação direta através da técnica de PCR, utilizando o kit Investigator® Argus Y-28 QS (QIAGEN). Os produtos da PCR foram genotipados através de eletroforese capilar, utilizando o 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems™). Foram determinados os parâmetros forenses através da ferramenta STRAF (STR Analysis for Forensics), e os Haplogrupos através do Nevgen Y-DNA Haplogroup predictor. Resultados e Discussão A análise dos 252 indivíduos revelou uma elevada diversidade genética. Destes 252 haplótipos, 250 são distintos e 248 desses são únicos, o que corresponde a uma frequência de haplótipos únicos de 98.4%, refletindo a alta variabilidade genética presente na amostra. Foi também obtida uma diversidade haplotípica (HD) alta (99%), e a capacidade discriminatória (DC) obtida foi de 99,2%, o que reforça o poder que o conjunto de marcadores estudado apresenta para distinguir entre indivíduos. Foi possível inferir haplogrupos para 230 amostras, e desta análise verificou-se que o Haplogrupo mais comum no pool de amostras analisado é o R (65%), bastante comum na Europa ocidental, seguido do E (12%), que apesar de ter originado em África, é comum na Ibéria. Conclusão A análise dos marcadores genéticos revelou um excelente desempenho em termos de variabilidade e capacidade de discriminação. A elevada variabilidade genética na amostra analisada é notória através do número elevado de haplótipos distintos e elevada frequência de haplótipos únicos, sendo a ascendência de maioritariamente europeia dos indivíduos, demonstrada através da distribuição dos mesmos. Os resultados obtidos contribuirão, não só para o conhecimento acerca da população e do seu background genético, mas também a sua inserção na base de dados vai auxiliar na expansão dos haplótipos descritos de Portugal, possibilitando uma base de dados mais robusta e completa, com utilidade em casos forenses futuros.
- Análise de 26 Loci Y-STR em Amostras da população cabo-verdiana para fins forensesPublication . Costa, Rita; Fadoni, Jennifer; Amorim, António; Cainé, Laura; Cainé, LauraIntrodução Cabo Verde é um arquipélago atlântico cuja população resulta de séculos de migração entre a África subsaariana e a Europa. Esta complexa história demográfica, aliada à forte ligação migratória com Portugal, levanta importantes questões em genética forense, sobretudo devido à sub-representação da população cabo-verdiana em bases de dados internacionais como a YHRD. Os marcadores STR do cromossoma Y (Y-STRs), particularmente os loci de mutação rápida, são amplamente utilizados na investigação forense, nomeadamente em casos de agressão sexual e testes de paternidade. A interpretação fiável destes perfis depende da disponibilidade de dados populacionais específicos. Este estudo teve como objetivo determinar as frequências alélicas, a diversidade haplotípica e os parâmetros forenses de 26 loci Y-STR a partir de amostras de indivíduos não aparentados com ancestralidade paterna cabo-verdiana. Materiais e Métodos Foram analisadas 143 amostras de sangue ou saliva de indivíduos do sexo masculino não relacionados geneticamente, com ancestralidade paterna cabo-verdiana, disponíveis no INMLCF, I.P. Os perfis genéticos foram obtidos através da amplificação por PCR dos 26 loci Y-STR com o kit Investigator® Argus Y-28 QS (QIAGEN). Foram calculadas as frequências alélicas e haplotípicas, inferidos os haplogrupos com base nos haplótipos, e determinados os parâmetros forenses relevantes para avaliação da discriminação e aplicabilidade em contexto forense. Resultados e Discussão Foram identificados 135 haplótipos distintos entre os 143 indivíduos analisados, dos quais 127 eram únicos. A capacidade de discriminação (DC) obtida foi de 0,944, refletindo o elevado poder discriminativo do painel de 26 loci Y-STR. A diversidade haplotípica (HD) foi de 0,999 e a diversidade genética média (GD), calculada individualmente para cada locus, variou entre 0,497 (DYS391) e 0,859 (DYS627). Os haplogrupos Y foram inferidos com base nos haplótipos, observando-se um predomínio de linhagens típicas Africanas (E1b1a e E1b1b), seguidas por contribuições Europeias (R1b), refletindo a ancestralidade mista característica da população cabo-verdiana. Conclusão Estes resultados demonstram a elevada diversidade haplotípica da população cabo-verdiana e confirmam a eficácia dos 26 marcadores Y-STR analisados na diferenciação de indivíduos do sexo masculino neste contexto populacional. A distribuição dos haplogrupos reflete a ancestralidade mista africana e europeia desses indivíduos. A disponibilização dos resultados obtidos contribuirá para reforçar a representatividade da população cabo-verdiana em bases de dados internacionais e para aumentar a robustez das análises forenses e estatísticas em casos que envolvam indivíduos com esta ancestralidade.