Resolução de discrepâncias alélicas em marcadores STR através de tecnologias de sequenciação de nova geração (NGS)

Nascimento, Rui; Afonso Costa, Heloísa; Amorim, António

http://hdl.handle.net/10400.26/59558

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Authors

Nascimento, Rui

Afonso Costa, Heloísa

Amorim, António

Abstract(s)

A tipagem de microssatélites (STRs) constitui um pilar da genética forense, baseando-se na inferência dos alelos através do tamanho dos fragmentos de DNA obtido por eletroforese capilar. No entanto, a obtenção de perfis genéticos discrepantes, para um mesmo marcador STR, entre diferentes kits comerciais levanta dúvidas quanto à veracidade dos resultados. Neste trabalho, apresentamos o caso de estudo de uma amostra forense que exibiu resultados discrepantes para o locus D2S1338. Com o kit GlobalFiler foi obtido o perfil genético 18.2, 23 enquanto que com o kit PowerPlexFusion6C foi determinado o perfil genético 18, 23. Tendo em conta a ausência de evidência de drop in alélico, e após reanálise dos resultados, tornou se imprescindível recorrer a uma abordagem que permitisse a leitura direta da sequência, e não apenas a inferência pelo tamanho. Para tal, recorreu-se à sequenciação da amostra por tecnologias de NGS, onde é possível efetuar uma sequenciação efetiva dos fragmentos, por oposição à eletroforese capilar onde é analisado apenas o tamanho do fragmento. Para o procedimento de NGS, procedeu se à extração de DNA segundo protocolos validados, seguida da construção de bibliotecas com o painel Precision ID GlobalFiler™ NGS STR Panel v2. A preparação das bibliotecas e carregamento do chip foi feita de forma automática na plataforma Ion Chef, e a sequenciação foi feita com recurso à plataforma Ion GeneStudio™ S5 System. A análise primária foi realizada no Torrent Suite™, com alinhamento das sequências ao genoma de referência (hg19). A análise secundária foi feita com recurso ao software Converge™. Os resultados de NGS confirmaram a presença efetiva dos alelos 18 e 23 no locus D2S1338, explicando a discrepância observada entre os dois kits comerciais e validando o verdadeiro resultado para este marcador. A discrepância entre os resultados obtidos pelos kits utilizados na eletroforese capilar deveu-se a uma mutação InDel, na zona intercalar entre a zona de ligação dos primers e o marcador STR. Uma mutação deste tipo altera o tamanho final do amplicão que irá ser observado por eletroforese capilar, obtendo-se assim um perfil genético incorreto para este marcador. Este caso de estudo sublinha a importância da integração da tecnologia NGS como ferramenta complementar na prática forense, especialmente em situações de perfis genéticos discrepantes ou amostras degradadas. A sequenciação direta dos STRs torna a tipagem genética mais robusta e reduz ambiguidades. Esta abordagem reforça a fiabilidade dos resultados, tanto em investigações criminais como na validação de perfis em bases de dados forenses.