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- Metodologias para preparação e extração de ADN de fragmentos humanos antigos: uma revisão preliminarPublication . Franco, Magda; Correia Dias, Helena; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO Laboratório de ADN Antigo do Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) tem como objetivo, entre outros, analisar fragmentos humanos antigos (ossos e dentes). Pretende assim, através de análises genéticas, contribuir para estudos relacionados com a evolução de populações antigas humanas, assim como a sua relação com a população atual. A reduzida quantidade de ADN e o elevado nível de degradação são dois dos desafios mais comuns quando se trabalha com ADN antigo (aDNA). É crucial diferenciar o ADN exógeno do aDNA autêntico, visto que estas amostras estão sujeitas a contaminações ambientais e humanas. Tendo em conta a pouca qualidade esperada das amostras, será mais eficaz o estudo do ADN mitocondrial (mtDNA) do que do ADN nuclear, já que o mtDNA está presente nas células num maior número de cópias e apresenta uma configuração molecular circular fechada, que resulta numa maior proteção. Por outro lado, como este ADN é herdado apenas por via materna, o seu estudo não é muito utilizado nas identificações individuais, mas é uma fonte importante de ADN para realizar estudos populacionais, sendo que nos permite obter informações sobre as linhagens maternas dos indivíduos. De acordo com a literatura, os métodos de pré-processamento usados antes da extração de ADN podem afetar a autenticidade e a quantidade de ADN obtido. Várias técnicas de pré-tratamento são utilizadas atualmente, tais como, limpeza da superfície do osso com lixívia, seguido de limpeza com água e, por fim, com etanol. Também é utilizada luz UV para garantir que o ADN extraído será autêntico e não de fontes exógenas. Em análises forenses, os dentes e ossos são normalmente reduzidos a pó para a extração de ADN. Tem sido também demonstrado que é possível obter bons resultados com um método diferente -"scrapping"-, sendo que esta técnica preserva melhor a amostra. No entanto, é necessário avaliar a idade, o estado e o nível de degradação do osso/dente, sendo que amostras frágeis podem ser quebradas facilmente, mesmo com este método. Na fase de extração, existem vários métodos que podem ser usados: métodos baseados em colunas (rápidos,mas produzem pouca quantidade de ADN); e métodos baseados em sílica, precipitação e microfiltros (demorados e trabalhosos, mas produzem melhores resultados). Também existe o método de fenol-clorofórmio (ainda de referência e utilizado por vários anos), que é trabalhoso e envolve riscos para o operador. Em suma, é importante fazer uma revisão dos métodos mais adequados para o tratamento e extração destas amostras difíceis, tendo em conta a manutenção da integridade das mesmas, para que possam ser utilizadas em investigações futuras ou expostas em museus. Assim, esta revisão serve como um primeiro passo para a implementação das metodologias mais adequadas para a obtenção de aDNA autêntico de restos humanos antigos para estudos futuros no Laboratório de ADN Antigo do INMLCF.
- ADN antigo: perspetivas e desafiosPublication . Correia Dias, Helena; Franco, Magda; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO DNA antigo (aDNA) pode ser uma fonte crucial de informação para estudos sobre a evolução e história das populações, revelando aspetos importantes, como migrações e interações humanas. Desde o primeiro estudo baseado no isolamento de aDNA, em 1984, novos desafios e oportunidades surgiram na área. Ao longo dos anos, com as melhorias técnicas nos métodos de extração de ADN e a emergência de novas metodologias de sequenciação de alto rendimento, como massive parallel sequencing, foram também impulsionadas novas perspetivas neste campo. Os restos humanos antigos, provenientes de escavações arqueológicas e de coleções museológicas, podem ser difíceis de analisar, principalmente devido à contaminação por ADN moderno, à degradação e exiguidade do aDNA, à contaminação laboratorial, ao armazenamento incorreto, às condições ambientais, entre outros. Além disso, apesar de muitos métodos de pré-tratamento terem sido propostos, poucos estudos relatam a preservação da estrutura e integridade do espécime. Os ossos e dentes são, muitas vezes, a única evidência da existência de um indivíduo ou população e devem ser analisados, mas essencialmente preservados. A análise de aDNA consiste, resumidamente, na preparação da amostra (usando, preferencialmente, um método não invasivo), extração de ADN, quantificação de ADN, PCR e sequenciação. O processo de preparação da amostra é determinante devido às características particulares do aDNA, como a baixa quantidade e a extensa degradação. Uma das questões mais importantes é a autenticidade do aDNA, sendo essencial minimizar o risco de contaminação por ADN moderno. Na extração de ADN, considerando amostras museológicas, é necessário selecionar um método não destrutivo, seguido de um método de quantificação preciso, que permita também otimizar a extração e detectar inibidores da PCR. A PCR deve também ter características específicas, comparando com a amplificação tradicional. Uma PCR dividida em dois passos é essencial para ultrapassar os artefactos do aDNA degradado. É aconselhável fazer múltiplas reações de PCR da mesma amostra e depois sequenciar as réplicas por sequenciação de Sanger. Após alinhamento e comparação das múltiplas sequências, a sequência de interesse é obtida. Recentemente, o Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro (SGBF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) criou um Laboratório de ADN Antigo com o objectivo principal de estudar amostras arqueológicas com diferentes intervalos post-mortem. Considerando que a análise de aDNA desempenha um papel crucial nos estudos arqueológicos e paleogenómicos, o objectivo da presente comunicação é divulgar e partilhar na comunidade científica o nosso novo Laboratório de ADN Antigo do INMLCF e mostrar o seu potencial para a expansão da investigação em aDNA, sendo que este laboratório está integrado num projecto científico que estuda comunidades da pré-história recente, na região centro de Portugal (MEDICE II).
- Aplicação forense de marcadores genéticos de ancestralidade biogeográfica e características visíveis externamente: interpretação e relatório pericialPublication . Afonso Costa, Heloísa; Amorim, António; Nascimento, Rui; Cainé, Laura; Cunha, Eugénia; Corte Real, FranciscoA capacidade de multiplexação da sequenciação massiva em paralelo (MPS), em simultâneo com a capacidade de análise de diversos tipos de marcadores genéticos, conduziu a genética forense a uma utilização mais frequente dos polimorfismos de nucleotído único (SNPs). Iniciaram-se, também, as análises denominadas Forensic DNA Phenotyping (FDP) que incluem a inferência da ancestralidade biogeográfica (BGA) e a inferência das características visíveis externamente (EVC) a partir de uma amostra biológica. Características que poderão orientar a investigação e a pesquisa em registos, dotando o ADN da capacidade de atuar como testemunha. No entanto, a interpretação de genótipos e haplótipos de BGA pode ser desafiadora, faltando ainda, orientações e harmonização sobretudo sobre a forma de expor os resultados obtidos. Este trabalho tem como objetivos apresentar o método desenvolvido no Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Sul (SBGF-S) para a determinação dos marcadores BGA e EVC; e apresentar um modelo de relatório pericial que pretende explanar os procedimentos a que a amostra foi submetida e traduzir os resultados em conclusões adequadas e percetíveis. Foram analisadas amostras colhidas após consentimento informado livre e esclarecido aprovado pela comissão ética e científica do INMLCF. As amostras foram extraídas com PrepFiler Express BTA™ Forensic DNA Extraction Kit e quantificadas com Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit. A preparação de bibliotecas de 41 SNPs autossómicos informativos para a EVC, 163 SNPs autossómicos de ancestralidade, e 116 Y-SNPs específicos de linhagem paterna incluídos no Ion AmpliSeq™ PhenoTrivium Panel, foi realizada de forma manual. A preparação de bibliotecas de ADN mitocondrial (ADNmt) foi realizada num equipamento Ion Chef™ com o Precision ID mtDNA Whole Genome Panel. A preparação do template e carregamento do Ion 530™ Chip foi realizada num Ion Chef™ utilizando o Ion S5™ Precision ID Chef & Sequencing Kit. A sequenciação foi realizada num Ion GeneStudio™ S5 System. A análise primária da sequência detetada foi realizada no Servidor Torrent em relação ao genoma de referência, hg19. A tipagem genética foi realizada utilizando o plugin HIDGenotyper-2.2 e a previsão BGA foi determinada com o Converge™ Software, baseada num método de bootstrap e um intervalo de confiança de 95%. A população de referência utilizada, compreende sete populações da base de dados ALFRED: África, América, Leste Asiático, Europa, Oceânia, Sul da Ásia e Sudoeste Asiático. A ancestralidade paterna e materna foi determinada recorrendo ao software YLeaf e à base de dados EMPOP, respetivamente. A predição do fenótipo foi obtida usando o Erasmus HPS Webtool. O conjunto dos SNPs autossómicos de ancestralidade, SNPs específicos de linhagem paterna e materna, e SNPs autossómicos fenotípicos, escolhidos, mostraram-se adequados para a determinação da BGA e EVC de uma amostra desconhecida, tendo sido elaborado o relatório pericial modelo.
- Body fluid identification and donor association of mock case samples: Results of two EDNAP collaborative exercisesPublication . Hänggi, Nadescha; Amorim, António; Afonso Costa, Heloísa; D. Andersen, Jeppe; Morling, Niels; Kampmann, Marie-Louise; Courts, Cornelius; Gosch, Annica; Neis, Maximilian; Syndercombe Court, Denise; Giangasparo, Federica; Elida Fonneløp, Ane; Johannessen, Helen; Hadrys, Thorsten; Parson, Walther; Niederstätter, Harald; Sidstedt, Maja; Sijen, Titia; van den Berge, Margreet; Hanson, Erin; Ballantyne, Jack; Haas, CordulaThe European DNA Profiling Group (EDNAP) has previously evaluated the performance, robustness, and reproducibility of various mRNA markers for identifying body fluids using capillary electrophoresis (CE) and massively parallel sequencing (MPS) methods. MPS of mRNA targets is used for body fluid identification and provides information on who contributed which body fluid to a binary mixture, thereby adding important contextual aspects to a crime scene investigation. The analysis of coding region SNPs (cSNPs) in body fluid-specific transcripts allows the association of an individual’s DNA cSNP profile with the body fluid-specific RNA cSNP genotype. The Zurich Institute of Forensic Medicine in Switzerland organized two consecutive collaborative exercises within the EDNAP group to evaluate the performance of two targeted mRNA sequencing assays: the BSS cSNP assay (for blood, saliva, and semen) and the 6F cSNP assay (for six fluids/tissues, including BSS and additionally vaginal secretion, menstrual blood, and skin). Each cSNP RNA assay was accompanied by a genomic DNA assay to genotype the cSNPs in the person(s) of interest. Eleven laboratories participated in one or both of the EDNAP collaborative exercises. In each exercise, 16 mock case samples were provided by the organizers, and the laboratories could analyze additional, self-prepared stains. Participants could use either the Ion S5 or the MiSeq sequencing platform. Here, we present the compiled results of the two collaborative exercises. We investigated DNA and RNA yields, STR profiles, and RNA profiles for body fluid identification and body fluid - donor association. While the mock case samples provided information on the performance of the assays, the self-prepared stains were a blind test for the organizers to identify the body fluids and the contributors.
- Lisbon population mtDNA analysis: study of a genetic marker with population, evolution and forensic interestPublication . Afonso Costa, Heloísa; Amorim, António; Vieira da Silva, Cláudia; Porto, Maria João; Cunha, Eugénia; Lemos, Manuel Carlos; Corte Real, FranciscoMitochondrial DNA mtDNA is remarkable in population genetic studies to clarify the history and demographic past of human populations For forensic purposes mtDNA analysis is particularly useful when there are degraded or low-level DNA samples Nonetheless, only being in possession of the genetic reference data of the populations it is possible to attribute statistical weight to evidence in forensic casework.The National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences in Portugal carried out a study with the aim of portraying the genetic diversity of immigrants living in Lisbon However, the nonimmigrant population of Lisbon, the reference population, had not yet been studied The present study intends to determine the mtDNA variability of the Lisbon metropolitan native population. Among the 90 samples, 87 unique mtDNA haplotypes were identified It was verified that 32 of the haplotypes had no coincidence and 14 of the haplotype had only one coincidence on EMPOP database This low frequency of the majority of the haplotypes emphasizes the importance of studying this population The most frequent haplotypes, enclose haplogroups H 1 HV, K 1 R 0, and U 5 belonging predominantly to west Eurasian mtDNA Haplotypes that belong to Haplogroups L 0 L 1 L 2 L 3 were also identified in Lisbon population.
- ADN mitocondrial: Estudo de validação interna de metodologia de sequenciaçãoPublication . Domingos, Margarida; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Feiteiro, Mariana; Corte Real, Francisco; Amorim, AntónioEm genética forense, a sequenciação do ADN mitocondrial (ADNmt) pode ser uma ferramenta crucial designadamente sempre que não é possível obter ADN nuclear (ADNn) analisável, a partir das amostras biológicas. Amostras recolhidas em cadáveres em avançado estado de decomposição e cabelos ou pêlos recolhidos em local de crime são exemplos de amostras biológicas a partir das quais a análise do ADNmt pode ser o único meio de prova genético. O ADNmt é vantajoso por existir em maior quantidade do que o ADNn, mas tem a desvantagem de ser um elemento não individualizante, sendo comum a todos os indivíduos da mesma linhagem materna. O Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF), está a implementar a sequenciação massiva em paralelo (MPS), sequenciação de segunda geração. A MPS, relativamente à técnica de sequenciação de Sanger (SS), tem como vantagens, desde logo, permitir sequenciar o genoma mitocondrial completo e oferecer a capacidade de analisar múltiplas amostras biológicas em simultâneo. Com o objetivo de implementar e validar a sequenciação do genoma mitocondrial por MPS foi avaliada a concordância entre as metodologias SS e MPS. Foram selecionadas 64 amostras biológicas, previamente estudadas e analisadas pela metodologia SS. Para o estudo pela metodologia MPS as amostras foram extraídas com PrepFiler Express BTA™ Forensic DNA Extraction Kit e quantificadas com Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit. A preparação de bibliotecas de ADNmt foi feita num equipamento Ion Chef™ com o Precision ID mtDNA Whole Genome Panel e o Precision ID DL8 Kit. Na quantificação das bibliotecas de ADNmt foi utilizado o Ion Library TaqMan™ Quantitation Kit. A preparação do template e carregamento do Ion 530™ Chip foi realizada no Ion Chef™ com os kits Ion S5™ Precision ID Chef & Sequencing Kit. A sequenciação, através da deteção de alterações de pH provocada pela libertação de iões de hidrogénio (H+), ocorridas durante a polimerização do ADN e incorporação de bases, foi realizada num Ion GeneStudio™ S5 System e em conjunto com o sistema Ion Torrent™ que determinou a sequência da molécula em estudo, transformando o sinal químico em sinal digital. A análise e determinação do haplótipo do ADNmt foi realizada com o Converge™ Software. O haplótipo de ADNmt determinado com as metodologias SS e MPS foi coincidente em todas as amostras. Adicionalmente, a metodologia MPS aumentou a eficiência e precisão na análise das amostras de ADNmt. A simplicidade do sistema MPS elimina a necessidade de utilização de nucleotídeos modificados, de lasers, scanners e câmaras de deteção, garantindo exatidão na deteção dos polimorfismos. Este sistema garante ainda uma cobertura homogénea da sequência em estudo, até mesmo em regiões ricas em conteúdo GC e regiões homopoliméricas.
- Mitochondrial DNA data of Cabo Verde Immigrant Population Living in LisboaPublication . Afonso Costa, Heloísa; Morais, P.; Amorim, António; Vieira da Silva, Cláudia; Matos, S.; Marques Santos, R.; Espinheira, R.; Costa Santos, J.Mitochondrial DNA (mtDNA) analysis found an important role in forensic genetics, especially when nuclear DNA analysis does not give a conclusive response. It is a powerful tool to exclude samples as originating from the same matriline. Features that increase the vested interest of mtDNA are the high copy number per cell, maternal inheritance, absence of recombination, and high mutation rate. Due to the higher overall mutation rate, the control region is comparatively enriched in sequence variation and therefore its analysis is important to establish haplotypes and haplogroups. Haplogroup assignment became noteworthy to clarify the history and demographic past of a population. As well as occurring all over Europe, in Portugal, and particularly in Lisboa, immigrant populations are increasing. The Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses is carrying out a comprehensive genetic study with the aim of portraying the genetic diversity of the immigrants who live in Lisboa. Within that objective, the present study intends to: obtain the mtDNA variability of Cabo Verde Immigrant Population Living in Lisboa and classify haplotypes into haplogroups. The studied population shows great interpopulation genetic variability due to the high frequency of unique haplotypes. Cabo Verde immigrants living in Lisboa exhibit haplotypes that belong to haplogroups observed in native Africans and in West Eurasian. MtDNA control region typing is extremely useful as a technique to differentiate among degraded samples frequently found in forensic genetics and to establish its global frequency when having knowledge of the genetic structure of populations.
- Introdução de tecnologia NGS em laboratórios de Genética Forense: novos marcadores genéticos do tipo MicrohaplotiposPublication . Nascimento, Rui; Afonso Costa, Heloísa; Cunha, Eugénia; Amorim, António
- Caracterização genética dos imigrantes oriundos de Brasil, Cabo Verde, Angola, Moçambique e Guiné Bissau. Impacto da miscigenação na genética forensePublication . Marcelino, Miguel; Afonso Costa, Heloísa; Correia Dias, Helena; Corte-Real, Francisco; Amorim, AntónioPortugal recebeu um grande influxo de imigrantes oriundos de diversos países. Dentro destes destacam-se aqueles vindos de países pertencentes à Comunidade dos Países de Língua Portuguesa (CPLP). Em 2022 contabilizaram-se cerca de 350 000 imigrantes oriundos destes países, aproximadamente 45% do número total de imigrantes a residir em Portugal. A introdução destas populações imigrantes acrescenta variabilidade genética à população portuguesa pela introdução de variantes genéticas características de populações africanas e sulamericanas. Este facto deve ser avaliado para que na valorização das perícias de genética e biologia forenses a população de referência seja a mais representativa da realidade e se possa alcançar o valor de probabilidade mais correto. A valorização quantitativa da prova biológica é feita, calculando a razão da verossimilhança, Likelihood Ratio (LR). O LR é a razão de duas probabilidades condicionais, que indica o número de vezes que é mais provável a ocorrência dos perfis genéticos determinados admitindo a Hipótese 1 como verdadeira - o indivíduo é o contribuidor -, relativamente à ocorrência desses mesmos perfis admitindo a Hipótese 2 como verdadeira - um indivíduo ao acaso da população de referência é o contribuidor. É então necessário o conhecimento prévio das frequências alélicas, genéticas e haplotípicas da população de referência. A escolha da população de referência pode ser particularmente problemática nas perícias que envolvem imigrantes, já que não é óbvio qual a melhor população de referência a ser utilizada, se a do seu país de origem, se a do local onde está atualmente a residir, ou se a população de referência onde se deu a ocorrência (crime, desaparecimento, procriação). As populações de imigrantes a residir em Lisboa foram sendo estudadas desde 2012 no âmbito do projecto de investigação "A população de Lisboa do início do século XXI: caracterização genética dos novos habitantes oriundos do Brasil, Cabo Verde, Angola e Guiné Bissau". Foram determinadas as frequências alélicas de marcadores genéticos autossómicos, particularmente os da European Standard Set (ESS) e do Combined DNA Index System (CODIS). Foram determinadas as frequências alélicas de marcadores genéticos do cromossoma X, as frequências haplotípicas de marcadores genéticos do cromossoma Y e frequências haplotípicas da região controlo do ADN mitocondrial. Relativamente e mais particularmente ao estudo do ADN mitocondrial verificou-se que estes imigrantes apresentam maioritariamente haplótipos pertencentes a haplogrupos tipicamente africanos e sul-americanos. É importante considerar que a miscigenação contínua entre diferentes grupos étnicos gera uma maior diversidade genética sendo necessária a constante atualização das bases de dados referentes às populações de referência para garantir uma representação precisa e fornecer uma valorização da prova biológica consentânea com a realidade populacional.
- Estudo comparativo e de validação de ensaios de quantificação de DNA, total e fração masculina, em amostras forenses, com diferentes metodologias e equipamentosPublication . Feiteiro, Mariana; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Domingos, Margarida; Cunha, Eugénia; Corte Real, Francisco; Amorim, AntónioA Genética Forense utiliza o DNA como o alvo de análise, sendo este um dos objetos de estudo mais importantes na análise forense, devido ao seu elevado potencial de individualização. A análise das amostras biológicas é realizada com o intuito de identificar o perfil genético dos vários envolventes, sendo que a quantidade de DNA presente nas mesmas pode variar consideravelmente, dependendo dos fatores a que estão expostas, o que poderá colocar em causa a obtenção do seu perfil genético. A quantificação do DNA no âmbito da Genética Forense tem um papel relevante para a obtenção de bons resultados, permitindo a análise da quantidade e qualidade do DNA presente numa amostra biológica, de forma a adaptar o restante protocolo para a obtenção de perfis genéticos ideais. A técnica de qPCR é considerada uma das mais precisas e sensíveis para quantificação de DNA, permitindo acompanhar em tempo real, ciclo a ciclo, o produto amplificado, através da alteração no sinal de fluorescência, detetado pelo termociclador. Para a implementação e utilização de um método é necessária a sua prévia validação, de forma a testar as suas capacidades e determinar vantagens e desvantagens do mesmo. No Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Sul (SGBF-S) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF), procedeu-se à validação interna de dois procedimentos de quantificação de DNA: os kits Quantifiler Trio e Investigator Quantiplex aplicados aos equipamentos QuantStudio 5 Real-Time PCR System for Human Identification e CFX Opus 96 Real-Time PCR System, respetivamente. Ambos os kits apresentam como alvos de amplificação duas regiões de DNA autossómico, uma large e uma small, e uma região alvo masculina. Relativamente aos equipamentos estudados, estes utilizam um conjunto de até 6 filtros associados a determinados corantes fluorescentes, que permitem a deteção de fluorescência na amostra, traduzindo-se na quantificação de DNA na mesma. A validação dos dois ensaios foi baseada no documento de validação interna do serviço, Procedimento Geral de Validação de Ensaios, dos quais foram testados, através de amostras controlo de concentração conhecida, diversos parâmetros: especificidade, sensibilidade, repetibilidade, reprodutibilidade e capacidade de diferenciação de misturas de material genético feminino e masculino, assim como a análise de amostras reais de forma a mimetizar a rotina laboratorial. Até ao momento, através dos estudos realizados, permite-se afirmar que ambos os ensaios são específicos para DNA humano e têm vindo a apresentar resultados semelhantes e esperados para os parâmetros em estudo. Contudo, constatou-se que não é possível a determinação do índice de degradação no ensaio do kit Investigator Quantiplex, devido à incompatibilidade na deteção do fluoróforo correspondente ao fragmento de DNA large, necessário para o cálculo do mesmo.