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- ADN antigo: perspetivas e desafiosPublication . Correia Dias, Helena; Franco, Magda; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO DNA antigo (aDNA) pode ser uma fonte crucial de informação para estudos sobre a evolução e história das populações, revelando aspetos importantes, como migrações e interações humanas. Desde o primeiro estudo baseado no isolamento de aDNA, em 1984, novos desafios e oportunidades surgiram na área. Ao longo dos anos, com as melhorias técnicas nos métodos de extração de ADN e a emergência de novas metodologias de sequenciação de alto rendimento, como massive parallel sequencing, foram também impulsionadas novas perspetivas neste campo. Os restos humanos antigos, provenientes de escavações arqueológicas e de coleções museológicas, podem ser difíceis de analisar, principalmente devido à contaminação por ADN moderno, à degradação e exiguidade do aDNA, à contaminação laboratorial, ao armazenamento incorreto, às condições ambientais, entre outros. Além disso, apesar de muitos métodos de pré-tratamento terem sido propostos, poucos estudos relatam a preservação da estrutura e integridade do espécime. Os ossos e dentes são, muitas vezes, a única evidência da existência de um indivíduo ou população e devem ser analisados, mas essencialmente preservados. A análise de aDNA consiste, resumidamente, na preparação da amostra (usando, preferencialmente, um método não invasivo), extração de ADN, quantificação de ADN, PCR e sequenciação. O processo de preparação da amostra é determinante devido às características particulares do aDNA, como a baixa quantidade e a extensa degradação. Uma das questões mais importantes é a autenticidade do aDNA, sendo essencial minimizar o risco de contaminação por ADN moderno. Na extração de ADN, considerando amostras museológicas, é necessário selecionar um método não destrutivo, seguido de um método de quantificação preciso, que permita também otimizar a extração e detectar inibidores da PCR. A PCR deve também ter características específicas, comparando com a amplificação tradicional. Uma PCR dividida em dois passos é essencial para ultrapassar os artefactos do aDNA degradado. É aconselhável fazer múltiplas reações de PCR da mesma amostra e depois sequenciar as réplicas por sequenciação de Sanger. Após alinhamento e comparação das múltiplas sequências, a sequência de interesse é obtida. Recentemente, o Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro (SGBF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) criou um Laboratório de ADN Antigo com o objectivo principal de estudar amostras arqueológicas com diferentes intervalos post-mortem. Considerando que a análise de aDNA desempenha um papel crucial nos estudos arqueológicos e paleogenómicos, o objectivo da presente comunicação é divulgar e partilhar na comunidade científica o nosso novo Laboratório de ADN Antigo do INMLCF e mostrar o seu potencial para a expansão da investigação em aDNA, sendo que este laboratório está integrado num projecto científico que estuda comunidades da pré-história recente, na região centro de Portugal (MEDICE II).
- Metodologias para preparação e extração de ADN de fragmentos humanos antigos: uma revisão preliminarPublication . Franco, Magda; Correia Dias, Helena; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO Laboratório de ADN Antigo do Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) tem como objetivo, entre outros, analisar fragmentos humanos antigos (ossos e dentes). Pretende assim, através de análises genéticas, contribuir para estudos relacionados com a evolução de populações antigas humanas, assim como a sua relação com a população atual. A reduzida quantidade de ADN e o elevado nível de degradação são dois dos desafios mais comuns quando se trabalha com ADN antigo (aDNA). É crucial diferenciar o ADN exógeno do aDNA autêntico, visto que estas amostras estão sujeitas a contaminações ambientais e humanas. Tendo em conta a pouca qualidade esperada das amostras, será mais eficaz o estudo do ADN mitocondrial (mtDNA) do que do ADN nuclear, já que o mtDNA está presente nas células num maior número de cópias e apresenta uma configuração molecular circular fechada, que resulta numa maior proteção. Por outro lado, como este ADN é herdado apenas por via materna, o seu estudo não é muito utilizado nas identificações individuais, mas é uma fonte importante de ADN para realizar estudos populacionais, sendo que nos permite obter informações sobre as linhagens maternas dos indivíduos. De acordo com a literatura, os métodos de pré-processamento usados antes da extração de ADN podem afetar a autenticidade e a quantidade de ADN obtido. Várias técnicas de pré-tratamento são utilizadas atualmente, tais como, limpeza da superfície do osso com lixívia, seguido de limpeza com água e, por fim, com etanol. Também é utilizada luz UV para garantir que o ADN extraído será autêntico e não de fontes exógenas. Em análises forenses, os dentes e ossos são normalmente reduzidos a pó para a extração de ADN. Tem sido também demonstrado que é possível obter bons resultados com um método diferente -"scrapping"-, sendo que esta técnica preserva melhor a amostra. No entanto, é necessário avaliar a idade, o estado e o nível de degradação do osso/dente, sendo que amostras frágeis podem ser quebradas facilmente, mesmo com este método. Na fase de extração, existem vários métodos que podem ser usados: métodos baseados em colunas (rápidos,mas produzem pouca quantidade de ADN); e métodos baseados em sílica, precipitação e microfiltros (demorados e trabalhosos, mas produzem melhores resultados). Também existe o método de fenol-clorofórmio (ainda de referência e utilizado por vários anos), que é trabalhoso e envolve riscos para o operador. Em suma, é importante fazer uma revisão dos métodos mais adequados para o tratamento e extração destas amostras difíceis, tendo em conta a manutenção da integridade das mesmas, para que possam ser utilizadas em investigações futuras ou expostas em museus. Assim, esta revisão serve como um primeiro passo para a implementação das metodologias mais adequadas para a obtenção de aDNA autêntico de restos humanos antigos para estudos futuros no Laboratório de ADN Antigo do INMLCF.
- Avaliação da aplicação do software Euroformix-Casesolver na interpretação e valorização estatística de misturas complexas em casos criminaisPublication . Vieira Da Silva, Cláudia; Ribeiro, Teresa; Amorim, António; Carvalho, MónicaOs Kits comerciais de amplificação de STRs autossómicos para aplicação forense permitem obter informação genética com grandepoder de discriminação. Atualmente os kits mais recentes permitem obter poderes de discriminação que variam entre 1 x 10E18 (para 15 STRs autossómicos) e 1 x 10E26 (para 21 STRs autossómicos). Um número crescente de loci, contribui para que esse poder de discriminação aumente infinitamente. Por outro lado, os desenvolvimentos ao nível da bioquímica têm resultado na deteção de concentrações muito baixas de ADN, tipicamente descritas como amostras com baixa concentração, e posterior obtenção de perfis genéticos em vestígios biológicos, onde há pouco tempo atrás era quase impossível obter esses resultados. A obtenção de perfis genéticos, não pode ser dissociada da valorização estatística da respetiva prova pericial. Existem alguns softwares estatísticos disponíveis, entre os quais o “Euroformix-casesolver” e o LRMix, com modelos de cálculo distintos com aplicação na avaliação estatística dos casos criminais. A principal vantagem do “Euroformix-casesolver”, comparativamente aos softwares disponíveis, consiste na utilização da informação relativamente à intensidade de sinal do produto amplificado (altura em RFUs) e deste modo permite introduzir no cálculo a informação desta variável, avaliada até à presente data, de forma qualitativa. Este trabalho tem como objetivo a comparação de resultados de valorização da prova em casos forenses complexos com o Euroformix – Casesolver e LRMIX Studio. Foram selecionados três perfis genéticos de mistura, provenientes de casos complexos de investigação criminal com perfis genéticos de vítima e suspeito. Pretende-se efetivamente demonstrar que o “Euroformix-Casesolver” é uma ferramenta de cálculo muito eficaz e adequada para aplicação nos casos criminais forenses, sobretudo nos casos de misturas complexas em particular os que envolvem familiares.
- Estudo de Y-SNPs com os métodos de sequenciação de nova geração (NGS): aplicações forensesPublication . Nascimento, Rui; Afonso Costa, Heloísa; Cunha, Eugénia; Corte Real, Francisco; Amorim, AntónioNa genética forense, o estudo do cromossoma Y tem um papel essencial em amostras de misturas de ADN masculino-feminino, comum em casos de agressão sexual. Além disso, através do estudo do ADN do cromossoma Y é possível determinar o número de contribuintes do sexo masculino em amostras de misturas complexas onde estão presentes múltiplos homens. A determinação das linhagens paternas do cromossoma Y, pode ser feita através do estudo de microssatélites do cromossoma Y (do inglês, short tandem repeats, Y-STR) ou pelo estudo de polimorfismos de nucleótido único (Y-SNP). Os haplótipos determinados por Y-STR definem linhagens paternas relativamente próximas e fornecem informação biogeográfica escassa. Em contraste, haplótipos Y-SNP podem definir linhagens muito distantes e fornecer informações de ancestralidade biogeográfica mais precisa, devido a uma taxa de mutação inferior. No âmbito da genética forense, a tecnologia SNaPshot tem sido a mais utilizada para a determinação de Y-SNPs. Esta tecnologia, embora eficaz, é limitada na quantidade de Y-SNPs que pode analisar numa única reação, limitando a determinação de um haplótipo com resolução suficiente para estudos do âmbito forense. Nos últimos anos, a sequenciação de nova geração (NGS) emergiu como uma alternativa ao SNaPshot, pois permite a análise de um grande número de SNPs em simultâneo. Esta tecnologia pode sequenciar um grande número de marcadores do cromossoma Y, proporcionando uma inferência de haplogrupo Y de alta resolução. No entanto, as tecnologias NGS geram uma grande quantidade de dados que podem ser de difícil análise, inviabilizando a sua aplicabilidade em casos reais. Este trabalho tem como objetivos apresentar o método desenvolvido no Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Sul para a determinação dos haplogrupos do cromossoma Y, de uma forma simplificada, com recurso a ferramentas pós-sequenciação, "Open-Source" para determinação do haplogrupo e determinação da informação biogeográfica da linhagem paterna. Foram analisadas amostras colhidas após consentimento informado e esclarecido aprovado pela comissão ética e científica do INMLCF. A preparação de bibliotecas foi feita recorrendo ao painel Ion AmpliSeq™ PhenoTrivium Panel que inclui 116 Y-SNPs específicos de linhagem paterna. A sequenciação foi realizada no Ion GeneStudio™ S5 System recorrendo a Ion 530™ Chips. A análise primária da sequência detetada foi realizada no Torrent Server por comparação ao genoma de referência, hg19. Posteriormente a análise foi feita em ambiente Linux, os ficheiros BAM foram analisados utilizando o software Yleaf que assiste na determinação do Haplogrupo do cromossoma Y. A informação biogeográfica foi obtida recorrendo à base de dados da ISSOG Y-DNA Haplogroup Tree. O trabalho efetuado permite implementar um método de análise simples e eficiente dos dados obtidos por métodos de sequenciação NGS para o estudo de Y-SNPs, superando assim todas as limitações das tecnologias anteriores.
- A Influência Da Microbiota Intestinal Na Enteropatia Inflamatória Crónica CaninaPublication . Riera, Louise Noëline Emma Marie; Serra, Diana Jurado SantosA Enteropatia Inflamatória Crónica Canina (EICC) é uma patologia crónica que representa uma preocupação crescente em medicina veterinária. De facto, 10 a 20% dos casos observados em clínicas veterinárias de referência estão relacionados com distúrbios gastrointestinais. Trata-se de uma doença complexa e multifatorial que pode estar associada a diversos fatores, nomeadamente fatores genéticos, ambientais e imunitários. A EICC é uma doença que atualmente não tem cura e cujo tratamento visa o alívio dos sinais clínicos e a melhoria da qualidade de vida dos animais. A EICC é classificada de acordo com a resposta clínica ao tratamento. Embora alguns cães que sofrem de EICC necessitem de antibioterapia e imunossupressores, a grande maioria dos animais responde favoravelmente a modificações na dieta. De facto, a dieta é um elemento-chave nas EICC que pode desempenhar um papel benéfico ou eventualmente deletério no âmbito desta doença, já que alguns estudos demonstram que a dieta pode promover disbiose intestinal, mas também pode limitá-la, se for administrada corretamente. A disbiose corresponde a uma alteração significativa da composição e diversidade da microbiota intestinal que poderá estar associada ao desenvolvimento de inúmeras doenças, entre as quais a EICC. A comunidade científica tem-se preocupado em desenvolver terapêuticas inovadoras, mais seguras e eficazes que visam regular a composição da microbiota intestinal e, com isso, contribuírem para o tratamento de diversas patologias crónica, como a EICC. Nos últimos anos, surgiram novas opções de tratamento, como os probióticos, prebióticos, simbióticos, pós-bióticos e o transplante fecal que constituem estratégias terapêuticas promissoras no contexto desta patologia.
- Deteção molecular de infeções virais respiratórias na Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências ForensesPublication . Fadoni, Jennifer; Cainé, Laura; Amorim, AntónioOs testes moleculares desempenham um papel crucial na deteção precoce e no controle de infeções virais. No contexto forense, os testes moleculares de deteção viral são de extrema importância, pois permitem a identificação precisa de infeções virais que podem ter contribuído para a morte de um indivíduo. Esse diagnóstico post-mortem é crucial não apenas para determinar a causa da morte em casos suspeitos ou em surtos de doenças, mas também para proteger os profissionais que manipulam os corpos, garantindo que medidas de biossegurança adequadas sejam adotadas. Além disso, os resultados desses testes fornecem dados valiosos para a vigilância epidemiológica, ajudando a monitorar a disseminação de doenças e a implementar estratégias de saúde pública eficazes. O Laboratório de Virologia e de Análises Clínicas e Forenses (LV-ACF) da Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) realiza testes de deteção molecular do vírus de SARS-CoV-2 em amostras colhidas post-mortem de todos os cadáveres cuja autópsia é realizada pelo Serviço de Clínica e Patologia Forense da Delegação do Norte (SCPF-N) do INMLCF. O objetivo desse trabalho é apresentar e analisar os dados referentes aos testes de deteção viral realizados pelo LV-ACF ao longo de um ano, visando contribuir para a melhoria das estratégias de prevenção e controle de doenças virais. Entre 15/06/2023 e 15/06/2024, o LV-ACF da Delegação do Norte do INMLCF realizou 1113 testes de deteção molecular de material genético viral, a partir de zaragatoas nasofaríngeas colhidas post-mortem pelo SCPF-N, nomeadamente 741 testes de deteção molecular de SARS-CoV-2, dos quais 32 (4,32%) apresentaram resultado positivo e 24 (3,24%) apresentaram resultado indeterminável; 124 de deteção molecular de Gripe A, Gripe B e Vírus Sincicial Respiratório, dos quais 5 (4,03%) apresentaram resultado positivo para Gripe A. Não foi detetado nenhum caso de gripe B ou Vírus sincicial respiratório. A idade média dos indivíduos testados foi de 62 anos, com idades compreendidas entre 14 a 96 anos. Relativamente aos casos com resultado positivo, a idade média dos indivíduos com resultado positivo para SARS-CoV-2 foi de 67 anos, com idades compreendidas entre 25 e 95 anos. Em relação aos casos de Gripe A, a idade média dos indivíduos foi de 60 anos, com idades compreendidas entre 31 e 75 anos. Este amplo intervalo etário indica que as infeções virais não se restringiram a uma faixa etária específica, afetando tanto indivíduos jovens quanto idosos. O trabalho realizado pelo LV-ACF é fundamental para a vigilância epidemiológica, ajudando a identificar padrões de infecção e a orientar políticas de saúde pública. Além disso, fornece dados essenciais para a proteção dos profissionais de saúde e a implementação de medidas preventivas eficazes, especialmente em populações vulneráveis. A continuidade desses testes é crucial para uma resposta rápida e informada a surtos de doenças virais.
- Aplicação forense de marcadores genéticos de ancestralidade biogeográfica e características visíveis externamente: interpretação e relatório pericialPublication . Afonso Costa, Heloísa; Amorim, António; Nascimento, Rui; Cainé, Laura; Cunha, Eugénia; Corte Real, FranciscoA capacidade de multiplexação da sequenciação massiva em paralelo (MPS), em simultâneo com a capacidade de análise de diversos tipos de marcadores genéticos, conduziu a genética forense a uma utilização mais frequente dos polimorfismos de nucleotído único (SNPs). Iniciaram-se, também, as análises denominadas Forensic DNA Phenotyping (FDP) que incluem a inferência da ancestralidade biogeográfica (BGA) e a inferência das características visíveis externamente (EVC) a partir de uma amostra biológica. Características que poderão orientar a investigação e a pesquisa em registos, dotando o ADN da capacidade de atuar como testemunha. No entanto, a interpretação de genótipos e haplótipos de BGA pode ser desafiadora, faltando ainda, orientações e harmonização sobretudo sobre a forma de expor os resultados obtidos. Este trabalho tem como objetivos apresentar o método desenvolvido no Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Sul (SBGF-S) para a determinação dos marcadores BGA e EVC; e apresentar um modelo de relatório pericial que pretende explanar os procedimentos a que a amostra foi submetida e traduzir os resultados em conclusões adequadas e percetíveis. Foram analisadas amostras colhidas após consentimento informado livre e esclarecido aprovado pela comissão ética e científica do INMLCF. As amostras foram extraídas com PrepFiler Express BTA™ Forensic DNA Extraction Kit e quantificadas com Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit. A preparação de bibliotecas de 41 SNPs autossómicos informativos para a EVC, 163 SNPs autossómicos de ancestralidade, e 116 Y-SNPs específicos de linhagem paterna incluídos no Ion AmpliSeq™ PhenoTrivium Panel, foi realizada de forma manual. A preparação de bibliotecas de ADN mitocondrial (ADNmt) foi realizada num equipamento Ion Chef™ com o Precision ID mtDNA Whole Genome Panel. A preparação do template e carregamento do Ion 530™ Chip foi realizada num Ion Chef™ utilizando o Ion S5™ Precision ID Chef & Sequencing Kit. A sequenciação foi realizada num Ion GeneStudio™ S5 System. A análise primária da sequência detetada foi realizada no Servidor Torrent em relação ao genoma de referência, hg19. A tipagem genética foi realizada utilizando o plugin HIDGenotyper-2.2 e a previsão BGA foi determinada com o Converge™ Software, baseada num método de bootstrap e um intervalo de confiança de 95%. A população de referência utilizada, compreende sete populações da base de dados ALFRED: África, América, Leste Asiático, Europa, Oceânia, Sul da Ásia e Sudoeste Asiático. A ancestralidade paterna e materna foi determinada recorrendo ao software YLeaf e à base de dados EMPOP, respetivamente. A predição do fenótipo foi obtida usando o Erasmus HPS Webtool. O conjunto dos SNPs autossómicos de ancestralidade, SNPs específicos de linhagem paterna e materna, e SNPs autossómicos fenotípicos, escolhidos, mostraram-se adequados para a determinação da BGA e EVC de uma amostra desconhecida, tendo sido elaborado o relatório pericial modelo.
- Manutenção na TreviPapelPublication . Barreira, David Alexandre Videira; Simões, António SantosAtualmente, decorrem tempos importantes para a indústria, principalmente para a indústria Portuguesa, mantendo-se focada em acompanhar o desenvolvimento das suas concorrentes a nível nacional e internacional. É no enquadramento da indústria de papel que surge o estágio, com o objetivo de explorar a sua transformação e compreender assim todo o seu funcionamento. No presente relatório são abordados os indicadores de manutenção, na TreviPapel que é a empresa acolhedora do estágio. Por forma a explicar a produção, foram tidas em conta, todas as etapas no processo de transformação do papel. No decorrer do estágio foram realizadas atividades tendo em consideração todos os conhecimentos adquiridos no decorrer da vida académica enquanto estudante do ISEC.
- Intervenções de enfermagem de reabilitação na minimização de complicações da imobilidade em medicina intensivaPublication . Mestre, Joana Filipa Nunes Pires; Peças, DinaA imobilidade é um problema comum no internamento em Serviços de Medicina Intensiva e pode resultar em complicações como a perda de massa muscular, fraqueza, redução da capacidade funcional, aumento do tempo de internamento, entre muitos outros. A reabilitação funcional e a mobilização precoce são estratégias eficazes para minimizar o impacto da imobilidade e o Enfermeiro Especialista em Enfermagem de Reabilitação tem um papel importante neste processo. Para minimizar o impacto negativo da imobilidade é essencial a implementação de estratégias eficazes de reabilitação e de mobilização precoce, já que esta pode afetar praticamente todos os sistemas do corpo humano, sendo o sistema músculo-esquelético o mais afetado. A implementação de intervenções de reabilitação reduz o tempo de internamento, bem como as readmissões hospitalares. A mobilização precoce da pessoa através de exercícios ativos e passivos melhora a força muscular, a função pulmonar e a circulação sanguínea. A imobilidade prolongada provoca perda de massa muscular e diminuição da mobilidade articular, o que pode levar a complicações como úlceras por pressão e contraturas. A reabilitação respiratória pode ajudar a melhorar a capacidade pulmonar da pessoa e reduzir o risco de complicações respiratórias. Intervenções como o uso de cicloergómetro e de estimulação elétrica neuromuscular mostraram ser eficazes na prevenção de complicações físicas decorrentes da imobilidade, bem como os exercícios de amplitude de movimento ou as mobilizações/posicionamentos no leito. Deve ser avaliada a capacidade da pessoa para se movimentar e adaptar as intervenções de reabilitação de acordo com as necessidades individuais de cada um. A implementação de protocolos de mobilização precoce pelos enfermeiros especialistas em enfermagem de reabilitação pode ajudar a melhorar a qualidade de vida da pessoa após a alta hospitalar.