INMLCF - Comunicações Científicas e Pósteres
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- Aplicação de Y -STRs em casos forensesPublication . Vieira Da Silva, Cláudia; Viriato, Luís; Cruz, Carla; Lucas, Isabel; Ribeiro, TeresaNos últimos anos, o interesse no estudo do cromossoma Y tem aumentado continuamente, como aplicação forense e ao nível do estudo populacional. Os Y-STRs foram introduzidos no Serviço de Genética Forense para resolução de casos complexos, essencialmente de casos com ausência de pretenso pai.Inicialmente foi efectuado um estudo do haplotipo mínimo, constituído pelos sistemas DYS19, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393 e DYS385. Posteriormente, foram introduzidos os sistemas DYS437, DYS438, DYS439, GATA A 7.1, GATA A 7.2, GATA C4, GATA A10 e GATA H4.Cada indivíduo apresenta a individualização única da sua linha paterna, tendo sido obtidos 71 haplotipos diferentes referentes às 71 amostras analisadas. Foram efectuadas comparações dos haplotipos mínimos (DYS19,389I/II,390,391,392,393,385) com a Base Internacional do Cromossoma Y, não se tendo detectado haplotipos idênticos a algumas das amostras da população portuguesa, o que lhes confere características próprias da sua localização geográfica Apesar da ocorrência de possíveis mutações ao nível dos Y-STRs, esta metodologia é muito útil para a resolução de casos complexos de investigação de paternidade
- Diversidade Genética na População de Macau em 15 Loci STRsPublication . Cruz, Carla; Viriato, Luís; Vieira, Claudia; Ribeiro, Teresa; Espinheira, Rosa; Geada, HelenaDecorridos 450 anos de permanência de população portuguesa em território macaense, no dia 20 de Dezembro de 1999, teve lugar a transferência definitiva da soberania de Macau para a República Popular da China. Tendo como objectivo a caracterização genética de uma população originária e residente em Macau e posterior comparação com a população portuguesa, foi efectuado um estudo de um conjunto de 15 loci STRs, dos quais 13 constituem o sistema CODIS e 2 são pentanucleótidos (Penta E e Penta D)A população de Macau mostrou desvios do equilibrio de Hardy-Weinberg nos sistemas D3S1358, TH01, D8S1179, D16S539 e PENTA D, apresentando neste último o desvio mais significativo. Verifica-se que o locus PENTA E é o mais polimórfico e discriminante na população em estudo. A comparação da população macaense com a população portuguesa revelou alelos exclusivos da primeira nos sistemas D18S51 (alelo 24), PENTA E (alelo 24), D5S818 (alelo 7), D7S820 (alelo 9.1), CSF1PO (alelos 14 e 15), vWA (alelo13) e FGA (alelos 13, 16, 25.2 e 26.2). No sistema TPOX a distribuição das frequências alélicas é muito próxima da população portuguesa. Em relação a todos os outros loci, foram detectadas diferenças significativas das frequências dos alelos entre as duas populações. Comparando a população macaense com populações chinesas2,3, verifica-se que estas apresentam semelhanças quanto à distribuição dos alelos nos sistemas estudados, o que sugere proximidade entre as referidas populações.
- Identification by mtDNA of exchanged human body remainsPublication . Cruz, Carla; Ribeiro, Teresa; Vieira - Silva, Cláudia; Lucas, Isabel; Geada, Helena; Espinheira, RosaMtDNA offers some advantages over genomic DNA markers for the identification of human remains. Its sequence is completely determined and the high copy number increases the chance to obtain mtDNA in cases of limited quantity or degraded autosomal DNA. The maternal mode of inheritance without recombination during the meiosis process allows maternal lineage identification by a simple direct comparison of the mtDNA sequence of mother and child or between brothers and sisters. CASE HISTORY: Five Portuguese citizens were killed in African. Three of them were identified and removed to Portugal, where they were buried. Two children were reported as missing. One year later, two skeletons were found in a grave 500 metres from the crime scene. Genetic typing of DNA extracted from skeletal remains was performed in order to establish their identities. One of the mothers of the two missing minors was excluded from the maternity of the skeletal remains. The hypothesis was raised of an identity exchange of the three corpses previously removed to Portugal. These were then exhumed and subjected to genetic analysis to achieve biological identification. Although teeth and bones are reliable sources of DNA, it was difficult to obtain results namely from those retrieved in Africa. As we expected, these required more modifications to standard protocol. The state of the bones samples from this continent was poor, probably due to the humidity, temperature and other African environmental conditions and soil characteristics that accelerate the degradation process. Low amounts, high fragmentation, and contamination of the DNA are the main problems associated with this kind of sample. In some cases, increasing the amount of DNA helped to overcome the first problem, but in some others lead to negative results, which can be explained by an increase of Taq polymerase inhibitors in the mix reaction. Regarding the degraded DNA, the application of different primers to the HVI and HVII regions allowed the amplification of two shorter overlapping fragments for each region and the reconstruction of HVI and HVII sequences. Several dilutions of DNA extract were tested to decrease the hypothetical contaminants that would act as Taq polymerase inhibitors. The coincidence of each of the five body sequences with one of the alleged mothers suggests a maternal relationship. A fraternal relationship was detected between bodies 2 and 5. These share the same mtDNA sequence with mother 3. The results supported the hypothesis of exchanged human body remains. Autosomal STR loci analysis was performed and confirmed the identity of the human remains. MtDNA analysis was a useful tool to solve this case. Although it cannot be used to definitely identify the corpses, it provided evidence of a maternal relationship and, consequently, the exchange of human body remains.
- 16 Y-Specific STR Analysis in Human Remains IdentificationPublication . Vieira-Silva, Cláudia; Cruz, C.; Ribeiro, Teresa; Lucas, Isabel; Geada, H.; Espinheira, R.Forensic investigation often requires the use of degraded biological material, especially for determining the identity of human remains. Y-STRs, offer new perspectives for identification and kinship analysis especially on forensic deficiency cases 1 in complement of autosomal STRs. The non-recombining portion of the Y-chromosome is of value providing additional data in paternal lineage identification. The aim was the study of 16 Y-STR loci to perform human remains identification - the minimal Y-STR haplotype - DYS19, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS19, DYS389I/II, DYS385 – and – GATA A .1(DYS460), GATA A 7.2 (DYS461), GATA C4, GATA H4, DYS437, DYS438, DYS439 loci, that are part of the Y-chromosome quality control Group of the Spanish and Portuguese Group (GEPY) of the ISFG. Y-STR typing in degraded biological material has major technical challenges since each sample has unique characteristics. The best results were obtained in autopsy bloodstains may be due to the fact that the autolysis mechanisms are still incipient. Otherwise blood kept at 4º C for more than a year didn’t provide the same good results. Liquid blood samples from deceased individuals may contain porfirinic compounds from hemoglobin, powerful PCR inhibitors difficult to eliminate9. In bone and teeth samples the source of inhibitors may be a high amount of DNA from other micro-organisms such as bacteria and fungi which invade bone9 and probably this kind of contaminants can explain some of the results obtained in bones and teeth samples submitted to prolonged humidity, temperature environmental conditions and also adverse soil characteristics. The problem with the studied samples seems not to be DNA quantity but the out-of-control presence of inhibitors that interfere not only with the extraction but also with the amplification process because most of the results were obtained with a dilution of DNA extraction and adding more Taq, sometimes 2 or 3 fold. With these samples, it seems that the success or failure depends on each sample itself and it should be treated individually. The number of distinct factors connected to each sample is difficult to calculate, so it is necessary to make a few attempts in order to have as many results as possible.
- vWA STR Locus - Structure and variabilityPublication . Cruz, Carla; Vieira da Silva, Cláudia; Lucas, Isabel; Ribeiro, Teresa; Espinheira, Rosa; Geada, HelenaThe biological individualization of samples is studied through DNA STR loci analysis and is the principal goal of Forensic Genetics. STR loci study was initiated in the 90s on the majority of Forensic Laboratories. vWA is one of the most studied STR loci all over the world. It is included in any STR set proposed by Forensic Groups as the 13 core loci of the CODIS System used in routine cases by most Forensic Genetic Laboratories. When performing paternity investigation and identification cases with STR loci, once in a while we came through rare or new alleles. Sequencing is essential to confirm the structure of these alleles. Also in mutation cases, especially in primer binding mutation cases, allele sequence should be performed. The high primer binding mutation observed in this locus and the interest in structure analysis of rare alleles observed in certain population groups were the main reasons for performing vWA sequence. More than one hundred vWA samples have been sequenced with DNA Sequencing Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing with forward and reverse primers (Kimpton et al, 1992 GenBank M25858). Sequencing was performed in an ABIPRISM 377 DNA Sequencer and analyzed by Sequencing Analysis. In this study we will present the structural analysis of vWA alleles from allele 11 to allele 22 studied in two main populations – a Portuguese population and an African population mainly from Cabo Verde Islands and Angola
- Portuguese Population Study with 16 Y-STR LociPublication . Geada, Helena; Baptista, Joana; Felgueiras, Miguel; Vieira Da Silva, Cláudia; Cruz, Carla; Lucas, Isabel; Ribeiro, Teresa; Espinheira, RosaAlthough autosomal STRs are commonly used for forensic investigations, Y-chromosome STRs provide very useful information in paternity investigation cases without alleged father and investigation cases where paternal lineage identification can be assessed. The aim of this study is to present an extended 16 Y-STR Portuguese Population Database of 214 Southern Portugal individual samples for forensic purpose, including the 8 Y-STR minimal haplotype – DYS19, DYS389 I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS385 (Gusmão et al, 2001, D Syndercomb-Court, personal communication) and Y-STR loci included in the Y-Chromosome GEP-ISFG collaborative exercise – DYS437, DYS438, DYS439, DYS460, DYS461, GATA A10, GATA C4, GATA H4.When performing a 16 Y-STR study the genetic diversity was successfully increased. With the 8 Y-STR minimal haplotype, haplotype clusters can be detected involving several non-related individuals, whereas, with a 16 Y-STR haplotype, haplotype clusters involve only 2 or 3 non-related individuals. The 16 Y-chromosome STR haplotype seem to be extremely important to solve complex forensic cases and in population, studies to obtain unique paternal profiles and to determine specific population characteristics
- Aplicação do Powerplex Y System no estudo de casos de agressão sexualPublication . Vieira da Silva, Cláudia; Cruz, C.; Ribeiro, Teresa; Lucas, Isabel; Espinheira, R.O cromossoma Y é especificamente masculino, haploide e transmitido de pai para filho sem alterações, a menos que tenham ocorrido mutações A maior vantagem do estudo dos STRs do cromossoma Y, em contraste com os STRs autossómicos é a amplificação selectiva do ADN masculino. Os STRs do cromossoma Y têm propriedades de utilidade forense especialmente quando aplicados em vestígios biológicos provenientes de casos de agressão sexual, em que um suspeito masculino está envolvido, o que acontece praticamente na totalidade dos casos. Diversas metodologias são aplicadas desde há longa data no estudo de vestígios biológicos provenientes de agressões sexuais, como a pesquisa de espermatozóides, a pesquisa de esperma pela reacção de Fosfatase Ácida e o estudo do gene homólogo da Amelogenina Da amplificação desta região dos cromossomas sexuais resultam fragmentos com 106 pb do cromossoma X e 112 pb do cromossoma Y, mas, se o material biológico feminino estiver em muito maior quantidade que o masculino, ao realizar o estudo da Amelogenina pode ser difícil detectar o cromossoma Y. Neste estudo com aplicação do Powerplex® Y System detecta se de forma inequívoca a presença de material genético de origem masculina, obtendo se um perfil genético ou haplotipo que poderá ser comparado com o dos suspeitos. Este kit está comercialmente disponível e validado e permite a amplificação simultânea de 12 Y STRs DYS 19 DYS 385 a/b, DYS 389 I, DYS 389 II, DYS 390 DYS 391 DYS 392 DYS 393 DYS 437 DYS 438 DYS 439.Nos casos de agressão sexual, o ADN autossómico do agressor pode surgir mascarado com o da vítima conduzindo a uma “sobrerepresentação”do perfil genético da mesma Q uando os vestígios biológicos do agressor estão presentes em muito pequena quantidade e os resultados da fosfatase ácida para pesquisa de esperma são negativos, a pesquisa de Y STRs pode ser um complemento fundamental para a prova de que existe nas amostras estudadas material genético de origem masculina . A pesquisa de Amelogenina pode não ser a forma mais eficiente de comprovar a presença de material biológico masculino Nos casos em que a presença de material biológico masculino é escasso comparativamente ao da vítima (figura 2 ou quando ocorre delecção no gene da Amelogenina do cromossoma Y do agressor, este pode não ser detectado na análise de fragmentos, Nos casos em que se pode comparar o perfil genético das amostras com o perfil do suspeito, o estudo dos STRs autossómicos pode ser difícil de interpretar numa mistura de material biológico, sobretudo se estiver envolvido mais do que um suspeito O estudo dos Y STRs nestas amostras permite excluir imediatamente o(s) suspeito(s) se o perfil genético ou haplótipo não for coincidente. Se ocorrer coincidência dos resultados os restantes membros da mesma linha paterna não podem ser excluídos .Quando a vítima é um indivíduo do sexo masculino os resultados obtidos também são válidos, sendo possível identificar o perfil genético do agressor conhecendo o perfil genético da vítima, desde que não pertençam à mesma linha paterna.O Kit Powerplex®Y system poderá ser uma ferramenta muito útil para detectar quantidades mínimas de ADN masculino nas amostras recomendando se a sua utilização nos casos de agressão.
- Identificação Genética de Amostras Utilizadas na Determinação da Taxa de AlcoolemiaPublication . Cruz, C.; Vieira da Silva, Cláudia; Ribeiro, Teresa; Lucas, Isabel; Espinheira, RosaA condução sob influência de álcool é responsável por grande parte da sinistralidade rodoviária e a sua fiscalização tem constituído uma das medidas de prevenção dessa sinistralidade. A determinação da Taxa de Alcoolémia no Sangue (TAS) é um dos meios utilizados na fiscalização. No Serviço de Genética e Biologia Forense da Delegação de Lisboa ocorreram solicitações de identificação genética de amostras previamente utilizadas na determinação de TAS.A identificação genética consiste no estudo do perfil de ADN obtido a partir das referidas amostras e na posterior comparação com o perfil de ADN obtido a partir de amostras biológicas de referência, colhidas ao indivíduo sujeito a pesquisa de álcool ou, no caso de falecimento deste, com o perfil genético de familiares directos. Este trabalho descreve os procedimentos realizados na identificação genética das referidas amostras. A comparação dos perfis genéticos obtidos permitiu detectar coincidência/não coincidência ou presença/ausência de uma relação de parentesco entre os referidos perfis e, consequentemente, determinar a identidade da amostra.Este tipo de estudo pode constituir um importante complemento às provas estabelecidas para a detecção do estado de influenciado pelo álcool ou por substâncias estupefacientes ou psicotrópicas.
- Unhas : uma alternativa para Identificação HumanaPublication . Ribeiro, Teresa; Lucas, Isabel; Vieira da Silva, Cláudia; Cruz, C.; Espinheira, RosaNa identificação genética de restos cadavéricos humanos é fundamental a selecção do material biológico a submeter à análise genética, revestindo se de importância relevante a escolha das amostras mais adequadas ao estado dos restos cadavéricos A capacidade de estudar o ADN pela técnica de PCR (polimerase chain reaction) permite analisar quantidades de ADN reduzidas, isoladas a partir de dentes e de fragmentos ósseos, bem como a partir de unhas, contudo, o problema que surge quando se trabalha com ADN destas amostras è a degradação da cadeia de ADN que ocorre após a morte, a própria contaminação por ADN microbiano e/ou a presença de inibidores da PCR, Verificou se que dos 4306 indivíduos estudados em polimorfismos de ADN, pertencentes a exames forenses no âmbito do foro cível, 67 eram indivíduos cadáveres, que necessitaram de esclarecimento da sua identidade ou que eram intervenientes em exames de investigação biológica de filiação e para tal houve necessidade de recorrer a exumação. Em 73 destes indivíduos não foi possível trabalhar com amostras de sangue porque o estado do cadáver não o permitia Em alternativa, o estudo do perfil genético recaiu sobre outro material biológico disponível Os perfis genéticos de 5 indivíduos foram estudados a partir de unhas, comparados com dentes e/ou ossos do próprio e identificados por análise comparativa com os perfis dos supostos familiares.A identificação, pelas unhas, foi possível em 4 das 5 vítimas estudadas O facto de não ter sido possível obter um perfil genético num dos casos, pode dever se, provavelmente, à permanência do cadáver em água salgada (caso 2 Nos dentes, foram obtidos resultados porque a dentina e o esmalte protegem a polpa, constituída por grande densidade celular e deste modo, a recuperação do ADN é maior As unhas oferecem uma oportunidade para identificar cadáveres, por análise genética comparativa com supostos familiares, contudo há que ter em atenção que a taxa de sucesso dos resultados depende do tipo de material biológico, do estado de cadáver, do local em que o mesmo foi encontrado, do intervalo post mortem 4 Por outro lado, verificou se que, em alguns casos, os fragmentos amplificados de maiores dimensões são mais difíceis de detectar do que os de menores dimensões (caso 3 podendo este facto ser devido à molécula de ADN estar parcialmente fragmentada A metodologia de extracção de ADN das unhas torna se vantajosa relativamente à usada para os dentes e ossos Antes de se proceder à digestão proteolitica, os ossos são laminados com auxilio de serra eléctrica, em finíssimas lascas, e posteriormente reduzidos a pó por acção de azoto líquido, num criotriturador 6750 freezer mill No caso dos dentes, o procedimento é semelhante não havendo contudo necessidade de utilizar a serra Relativamente às unhas o procedimento inicia se com a digestão proteolitica, logo após a desinfecção inicial Deste modo, o protocolo de extracção de ADN das unhas torna se mais rápido e menos dispendioso Além disso a manipulação do azoto líquido acarreta riscos para o técnico uma vez que se trata de um gás inodoro e liquefeito a uma temperatura de 210 ºC, provocando acidentalmente queimaduras graves, e intoxicação sem que possam ser perceptíveis. As unhas são um meio alternativo para a identificação genética, contudo o perito médico legal deverá ter em consideração que para além das unhas deve colher outro tipo de amostra biológica
- South Portugal population genetic analysis with 17 loci STRsPublication . Vieira da Silva, Cláudia; Cruz, C.; Ribeiro, Teresa; Espinheira, R.STRs are the standard genetic markers mainly used in forensic cases. In routine casework it is important to establish a population genetic database for further reliable statistical analyses. AmpF1STRIdentifiler (Applied Biosystems) and Geneprint Powerplex 16 (Promega Corporation, Madison WI, USA) are multiplex kits wich co-amplifie 17 STR - loci including the segment of X-Y homologous gene Amelogenina routinely used in our laboratory. 13 core short tandem repeat loci standardized under the combined DNA Index System (Codis): CSF1PO, D3S1358, D5S818, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, vWA, FGA, TH01, TPOX, two additional tetranucleotide loci - D2S1338 and D19S433 – and two additional pentanucleotides – Penta E and Penta D. The purpose of this study is to determine the allele distribution data of the 17 STR loci in 2445 caucasian unrelated individuals from the south of Portugal, 176 unrelated individuals from Cabo Verde and 102 unrelated individuals from Angola and compare it with the values of the all the population resident in the same area. Allele frequencies for each locus observed heterozygosity, expected heterozygosity, power of exclusion, power of discrimination, and p values of chi-square test for departures from Hardy-Weinberg expectations were calculated.