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- Simultaneous analysis of some club drugs in whole blood using solid phase extraction and gas chromatography–mass spectrometryPublication . Castro, André Lobo; Tarelho, Sónia; Silvestre, Armando; Teixeira, Helena M.The use of psychoactive substances to improve social relations and increase body energy, in Rave Culture, has raised many legal and health public concerns, both for illicit trade and consumption. Therefore, forensic toxicology plays an important role in this area, mainly linked to the detection and quantitation of these substances, both in vivo and in post-mortem samples. In fact, at the moment, forensic sciences have been under public authorities’ scrutiny and critical look, due to the increasing attention of the media and public opinion, always applying for the use of scientific knowledge to help solving forensic cases. However, forensic toxicology results are only reliable to solve legal cases if all the analytical methodologies used are appropriately validated. In this work, a methodology for the extraction and analysis of 7-aminoflunitrazepam, buprenorphine, flunitrazepam, ketamine, methadone, phencyclidine (PCP) and d-propoxyphene was developed for whole blood samples, with Solid-Phase Extraction (SPE), using OASIS MCX SPE columns, and gas chromatography coupled to mass spectrometry. The procedure presented here proved to be reliable, specific, selective and sensitive, with good LODs and LOQs and good precision.The adoption of a SPE procedure with an automatic SPE extraction device, allowed an increased level of automation in sample treatment, being contemporarily less time-consuming, increasing productiveness, and allowing good recovery and appropriate selectivity being, also, simple and reproducible. The simultaneous detection and quantitation of all compounds by the same extraction and detection methodology is crucial and has a great potential for forensic toxicology and clinical analysis.
- Intoxicação por novas substâncias psicoativas: descrição de um casoPublication . Castro, André Lobo; Sousa, Lara; Quintas, Maria José; Pedro, Costa; Rangel, Rui; Melo, Paula; Carneiro De Sousa Pinto Costa, Maria José; Tarelho, Sónia; Franco, João MiguelIntrodução: As novas substâncias psicoativas (NPS) representam um contexto emergente no mundo desenvolvido, e Portugal não é exceção. Apresentando diversas designações no mercado ilícito, estes compostos surgem de forma regular, substituindo outros previamente identificados pelas autoridades. Desse modo, o “mercado ilícito” tenta circundar as autoridades fiscalizadoras, sendo exemplo a identificação de mais de cem (100) substâncias diferentes, por ano, quer em 2014, quer em 2015. Os dados referentes a intoxicações por estas substâncias são escassos e dispersos devido à referida “volatilidade” no mercado, a qual condiciona o cumprimento dos critérios necessários para a identificação de substâncias. Os autores reportam um caso de intoxicação multi-substâncias, onde se incluem NPS. Material e Métodos: No âmbito da autópsia médico-legal realizada a um indivíduo do sexo masculino, com 26 anos, foram solicitados exames toxicológicos complementares, para determinação de Etanol, Drogas de Abuso e Substâncias Medicamentosas. O procedimento analítico incluiu a extração em fase sólida (SPE) das substâncias de interesse com recurso a cartuchos HLB OASIS® (Waters), e a utilização de técnicas de análise instrumental hifenadas, nomeadamente um cromatógrafo de gases GC-450 acoplado a um espectrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo MS-300 (Bruker), um cromatógrafo de gases GC6780 acoplado a um espectrometro de massa do tipo quadrupolo simples 5973N (Agilent) e um Cromatógrafo líquido de ultra performance (UPLC), acoplado a um espectrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo (WATERS). Foram analisadas amostras de sangue periférico e da cavidade cardíaca e diversos vestígios encontrados junto ao cadáver. Resultados: A análise dos vestígios permitiu a identificação das seguintes substâncias: 3-MeO-PCP (1-[1-(3-metoxifenil)ciclohexil]piperidina), DPT (N,N-dipropiltriptamina), XLR-11 (1-[5-(fluoropentil)-1H-indol-3-il]-(2,2,3,3-tetrametilciclopropil)metanona; 5-MeO-DMT (2-(metoxi-1H-indol-3-il)-N,N-dimetiletanamina) e O-desmetiltramadol (O-DT). A análise do sangue periférico permitiu a determinação de: O-desmetiltramadol (4225 ng/mL), THC (1,20 ng/mL), THCCOOH (4,50 ng/mL), Mianserina (74 ng/mL), Topiramato (VE:6393 ng/mL) e Bromazepam (138 ng/mL). A análise do sangue da cavidade cardíaca permitiu a determinação da 3-MeO-PCP (VE: 525 ng/mL). Todos os outros compostos identificados nos vestígios não foram encontrados nas amostras de sangue analisadas. Discussão: A informação social e os dados da autópsia não permitiram o diagnóstico diferencial médico-legal entre suicídio e acidente. Em contrapartida, a presença de vários compostos leva a concluir que a morte terá sido devida a uma intoxicação multi-substâncias, com especial relevância para os efeitos devidos às NPS presentes no sangue (3-MeO-PCP e O-DT).
- Intoxicação por 1,4-Butanediol: descrição de um casoPublication . Castro, André Lobo; Dias, Ana Sofia; Melo, Paula; Tarelho, Sónia; Franco, João MiguelIntrodução: O Ácido gamahidroxibutírico (GHB) é um composto endógeno, com ação conhecida em diversas áreas cerebrais. O seu uso ilícito inclui objetivos recreativos, o incremento da massa muscular, e como substância facilitadora de abuso sexual. A disponibilidade de dois percursores, nomeadamente a Gamabutirolactona (GBL) e o 1,4-butanediol (1,4-BD), os quais não se encontram alocados à lista de substâncias controladas, contrariamente ao próprio GHB, torna ainda mais fácil a sua obtenção e consumo. Material e Métodos: Um indivíduo do sexo masculino, com 25 anos, deu entrada no Serviço de Urgência de um Hospital Central, em estado de coma (CGS 7), com suspeita de intoxicação por ingestão de líquido, o qual o acompanhava. O SQTF recebeu uma amostra de soro e o referido líquido para análise. O procedimento analítico incluiu a análise direta do líquido por GC-MS, para identificação do mesmo, e a análise da amostra de soro através de extração líquido-líquido das substâncias de interesse, seguida da utilização de técnica de análise instrumental hifenada, nomeadamente um cromatógrafo de gases GC-450 acoplado a um espectrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo MS-300 (Bruker). Resultados e Discussão: A análise do líquido permitiu a identificação da substância 1,4-Butanediol. A análise da amostra de soro permitiu a determinação de GHB numa concentração de 171 mg/L. Paralelamente, foi detetada, pela primeira vez, a presença do metabolito GHB-Glucuronizado (GHB-GLUC), metabolito este recentemente descrito. Conclusão: A informação hospitalar recebida indica que o indivíduo reverteu o estado comatoso, sem sugestão de sequelas neurológicas. Os dados clínicos e os resultados laboratoriais confirmam o diagnóstico de intoxicação por 1,4-Butanediol, detetado pela primeira vez no nosso país.
- Intoxicação por MDMA em Candidato a Dador de Coração Parado – Análise de um casoPublication . Castro, André Lobo; Almeida, Dina; Sousa, Lara; Costa, Pedro; Quintas, Maria José; Melo, Paula; Rangel, Rui; Tarelho, Sónia; Franco, João MiguelIntrodução: A dinâmica de consumo de substâncias ilícitas é caracterizada por tendências e “modas”, sempre com o objetivo de obter e experienciar os efeitos desejados, sejam estes de extremação sensorial, entactogénicos ou outros. No entanto, algumas substâncias mantêm‐se no mercado negro de forma consistente ao longo do tempo. É o caso das anfetaminas e dos seus derivados, as quais surgem de forma regular em casos de intoxicação. Os autores apresentam um caso ocorrido no norte de Portugal onde foi detetada MDMA em amostras post‐mortem, bem como em amostras recolhidas ao indivíduo ainda em contexto de emergência hospitalar, salientando‐se a excecionalidade deste procedimento. Material e Métodos: Trata‐se de um homem de 18 anos de idade, sem história conhecida de consumo de drogas de abuso. Foi ativado o INEM por inconsciência / suspeita de intoxicação por substância desconhecida. À chegada da equipa foi constatada respiração ruidosa, midríase fixa e hipertermia (temperatura auricular de 42ºC). Foram realizadas manobras de suporte básico e avançado de vida com administração de adrenalina. A vítima foi transportada ao serviço de urgência hospitalar e na primeira avaliação após constatação de assistolia, foram suspensas as manobras e a vítima foi avaliada e considerada como CDCP (Candidato a Dador de Coração Parado). Foi efetuada autópsia médico‐legal, tendo sido observada congestão visceral global e, a nível pulmonar, sufusões hemorrágicas subpleurais, edema marcado e áreas de hemorragia do parênquima. O exame anátomo‐patológico efetuado ao tecido pulmonar revelou a presença de hemorragia alveolar bilateral. Foram enviadas amostras de sangue periférico e da cavidade cardíaca para o SQTF para processamento analítico para pesquisa de etanol, drogas de abuso e substâncias medicamentosas. Posteriormente foram também recebidas amostras de sangue colhidas no SU com indicação da hora da colheita. Resultados e Discussão: A amostra de sangue periférico foi analisada, tendo sido verificada a ausência de etanol e a presença de lidocaína com uma concentração inferior a 500 ng/mL. O rastreio de drogas de abuso por imunoensaio sugeriu a presença de anfetaminas e derivados. A confirmação/quantificação de anfetaminas por GC‐MS‐single quad (LOD = 10 ng / mL), após o procedimento extrativo por SPE, revelou‐se positiva para MDMA [2278 ng / mL] e para MDA [49 ng / mL]. As amostras colhidas em contexto hospitalar mostraram‐se positivas para MDMA, com valores entre 504 ng/mL e 1918 ng/mL, e MDA, com valores entre 20 ng/mL e 89 ng/mL. Conclusões: Com o presente caso, os autores pretendem ressalvar que a análise dos resultados toxicológicos numa vítima submetida a procedimentos de colheita de órgãos para transplante carece de uma cuidadosa interpretação, tendo em conta o momento em que a colheita de amostra pode ser efetuada durante todo o processo, desde o internamento hospitalar até à realização da autópsia médico‐legal. Salienta‐se ainda a importância da comunicação com as unidades hospitalares, no sentido de, em casos específicos, poderem ser facultadas as amostras colhidas em contexto hospitalar, o mais próximo possível do momento do evento em estudo, tendo em conta que a concentração das substâncias pode alterar‐se durante a manutenção da vítima em suporte de vida.
- Imparcialidade pela ISO 17025 e distorção cognitiva em Toxicologia Forense – da imparcialidade consensual à distorção cognitiva minimizada. Quo Vadis?Publication . Tarelho, Sónia; Castro, André Lobo; Franco, João MiguelA norma ISO/IEC 17025:2018 contém uma nova secção que aborda a imparcialidade de uma forma mais estruturada do que a apresentada na versão anterior. Segundo a sua própria definição, trata-se da "presença de objetividade " e “a objetividade implica a ausência de conflitos de interesse ou a sua resolução de modo a não influenciar de forma adversa as atividades do laboratório". No entanto, a tomada de decisão subjetiva e a interpretação sob pressão e em circunstâncias limite são realidades bem presentes na vida de um toxicologista forense, podendo conduzir a um viés cognitivo, apesar da objetividade da toxicologia sustentada na química analítica e na respetiva instrumentação. Assim, e considerando esta preocupação emergente, abordada em diversos estudos já publicados (e.g. TIAFT 2019), constitui o objetivo deste trabalho a realização de uma reflexão sobre este tema, apresentando pontos críticos e as formas que o SQTF encontrou para minimizar ou eliminar os seus efeitos. A distorção percetiva pode surgir de diferentes fontes que podem ser organizadas em três categorias: categoria A, a informação específica associada ao caso; categoria B que se baseia no ambiente, na cultura e na experiência do analista (educação e formação) e a categoria C que enfoca na natureza humana. Embora existam estratégias conhecidas de minimização aplicáveis às técnicas de comparação (e.g. impressões digitais), ainda existem pesquisas limitadas sobre as estratégias de minimização ou de redução de desvios de interpretação em toxicologia forense. O primeiro passo para minimizar o viés cognitivo é a consciencialização. O segundo passo é a realização de uma revisão dos processos do laboratório para identificar pontos onde a distorção cognitiva possa ser um problema. Consequentemente, podem então ser utilizadas abordagens específicas em cada etapa, com base nos princípios do controlo da informação, da coerência, da responsabilização, da diversidade e da transparência. A distorção percetiva pode influenciar todo o processo de avaliação e de análise de um caso toxicológico. No entanto, são três as áreas principais identificadas: a seleção dos métodos ou a estratégia de análise, a triagem das substâncias a detetar (drug screening) e a interpretação dos resultados obtidos. O Serviço de Química e Toxicologia Forenses do INMLCF foi capaz de identificar pontos de implementação de procedimentos de minimização de desvios interpretativos e o próximo passo poderá passar pela incorporação numa política formal. Uma pesquisa anterior com membros da TIAFT evidenciou que apenas 14% trabalhavam em laboratórios que tinham uma política formal sobre viés contextual. Esta política formal sobre viés cognitivo deve ser separada daquelas que discutem a ética ou a imparcialidade, tendo sempre em linha de conta que o enviesamento cognitivo não é causado por desonestidade, fracasso pessoal, falta de comportamento ético ou ausência de profissionalismo.
- A Inteligência Artificial e o seu potencial na aplicação à Toxicologia ForensePublication . Tarelho, Sónia; Castro, André Lobo; Franco, João MiguelNos últimos anos, a inteligência artificial (IA) tem permitido avanços muito significativos em várias áreas, transformando diversos setores da nossa sociedade. Os mais importantes passam pelo Deep Learning, pelo processamento da linguagem natural (NLP), pela visão computacional, pela inteligência conversacional, pela robótica e automação, pela mobilidade autónoma e, no que à toxicologia forense importa, na medicina e nas ciências a ela associadas. Neste âmbito, a IA tem sido aplicada com sucesso em diversas áreas com o desenvolvimento de algoritmos que permitem analisar grandes quantidades de dados para auxiliar no diagnóstico e no tratamento médicos. Considerando a Toxicologia Forense em particular, a IA tem o potencial de desempenhar um papel importante, auxiliando na análise das evidências relacionadas com as substâncias tóxicas encontradas nas vítimas ou nos suspeitos (ou cenas de crime). As potencialidades de aplicação das ferramentas de IA incluem a análise de dados, a classificação das substâncias tóxicas, a previsão dos efeitos tóxicos, a análise de padrões de intoxicação, culminando no suporte à tomada de decisão. Assim, e considerando a expectativa intrínseca associada à IA, este trabalho pretende refletir sobre as potencialidades da sua aplicação ao âmbito da toxicologia forense. No contexto atual, e dada a recente realidade das novas drogas psicoativas (NPS), bem como a grande preocupação que esta traz para as autoridades de saúde e para os órgãos reguladores em todo o mundo, a aplicação da IA ao estudo da metabolização das substâncias (metabolómica) parece assumir uma importância emergente. Devido à natureza dinâmica e evolutiva desse mercado, é difícil acompanhar todas as novas substâncias psicoativas que vão sendo desenvolvidas e colocadas em circulação para consumo. Muitas vezes, a prática dos produtores passa pela alteração subtil das estruturas químicas das substâncias existentes para criar novos produtos que não estejam legalmente regulamentados. Esta realidade constitui um desafio para o controlo e para a proibição céleres destas substâncias pelas autoridades de saúde e pelos órgãos reguladores. Neste âmbito, a IA tem um elevado potencial, podendo ser aplicada eficazmente ao estudo da metabolização das várias formas e variantes, bem como na sua previsão e na identificação dos respetivos produtos de metabolização. É importante ressalvar que a aplicação da IA na toxicologia forense requer o uso de dados precisos e confiáveis, bem como a validação contínua dos modelos e dos algoritmos utilizados. Além disso, a interpretação humana e o conhecimento especializado continuam a ser fundamentais para uma análise forense completa, precisa e fundamentada. Assim, a IA deve ser vista como uma ferramenta complementar de auxílio à melhoria da qualidade da tomada de decisão por parte do especialista e não ser demasiadamente endeusada como um perfeito substituto da capacidade de pensamento e de discernimento humanos.
- Desenvolvimento e validação de uma metodologia por GC-MS-ECD para a determinação de inseticidas organofosforados em sangue totalPublication . Valente, Nuno I.P.; Tarelho, Sónia; Castro, André Lobo; Silvestre, Armando; Teixeira, HelenaIntrodução: Os pesticidas são substâncias destinadas a prevenir, destruir ou controlar pragas. No entanto, estes produtos são também responsáveis por intoxicações em seres humanos. Em Portugal, mais de metade das intoxicações voluntárias em humanos com pesticidas envolvem inseticidas organofosforados (IOFs). Neste trabalho, pretendeu-se desenvolver e validar um conjunto de metodologias para a determinação analítica de dez IOFs, nomeadamente, clorfenvinfos, clorpirifos, diazinão, dimetoato, fentião, fosalona, malatião, paratião, pirimifos-metilo e quinalfos, em amostras de sangue total e de conteúdo gástrico, tendo em vista a introdução das mesmas na rotina pericial do Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, Instituto Público (STF-N). Material and Métodos: Foram testados dois procedimentos de extração em fase sólida com colunas Oasis® HLB 3cc (da Waters) e um com colunas Sep-Pak® C18 3cc (também da Waters). Foi utilizada como técnica de separação um cromatógrafo de gás Agilent 6890N, acoplado a um espetrómetro de massa Agilent 5973N com um quadrupolo, e a um detetor de captura eletrónica Agilent G2397A. Resultados e Discussão: O método de extração com colunas Sep-Pak® C18 foi selecionado uma vez que no final do processo de extração e análise foram gerados sinais cinco vezes superiores aos obtidos após extração com as outras colunas de SPE, e mostrou ser seletivo para isolamento dos analitos e do padrão interno (etião) em amostras de sangue postmortem. Foram preparadas curvas de calibração entre 50 e 5000 ng/mL, utilizando modelos de regressão linear ponderada. Devido à sensibilidade mais baixa do detetor, não foi possível definir uma gama de trabalho para o fentião por GC-ECD, enquanto para o pirimifos-metilo esta foi estabelecida entre 500 e 5000 ng/mL. O limite de quantificação foi definido a 50 ng/mL para todos os analitos, à exceção do pirimifos-metilo por GC-ECD (500 ng/mL). A eficiência de extração média situou-se entre os 72 e os 102%. O método mostrou ser robusto e adequado ao propósito, tendo sido já aplicado na rotina do laboratório. Conclusão: Apesar de várias vezes descrita a utilização de GC-MS, não foi encontrada na literatura qualquer referência a trabalhos com GC-ECD em amostras biológicas humanas e, por isso, esta será a primeira descrição da utilização de um detetor de captura eletrónica acoplado a um cromatógrafo gasoso na análise deste tipo de amostras. A utilização de duas colunas de separação cromatográfica e dois detetores, GC-ECD e GC-MS, permitiu a realização da análise de rastreio por GC-ECD e de confirmação qualitativa por GC-ECD assegurando deste modo a existência de metodologias diferentes necessárias para a emissão de um resultado positivo. A quantificação é realizada por GC-MS. A utilização de dois sistemas cromatográficos num mesmo equipamento permite também a economia de recursos e espaço no laboratório, e disponibilidade do operador. A validação da metodologia com base na NP EN ISO/IEC 17025:2005 por via de um processo integrado e contínuo assegura a adequabilidade dos método e a qualidade dos resultados.
- Desenvolvimento e validação de um método de rastreio para Ketamina (KET) por imunoensaios enzimáticosPublication . Coelho, Francisco; Costa, Pedro; Melo, Paula; Quintas, Maria José; Tarelho, Sónia; Castro, André Lobo; Teixeira, HelenaIntrodução: Nas últimas décadas, têm sido frequentemente reportados casos em que drogas legais são utilizadas de forma ilícita/descontextualizada, sendo a ketamina um exemplo. A ketamina foi inicialmente desenvolvida como anestésico. No entanto, cedo passou a ser também classificada como “club drug”, tendo um caráter alucinogéneo e funcionando como anestésico dissociativo, dados os distúrbios psiquiátricos de tal ordem graves que causava e causa nos pacientes/consumidores. O objetivo principal deste trabalho foi o desenvolvimento e validação de um método de deteção da ketamina por imunoensaios enzimáticos (método de rastreio) em amostras de sangue total e de urina, in vivo e post-mortem, de forma a que seja posteriormente aplicável na rotina deste serviço. Materiais e Métodos: Os imunoensaios foram realizados num equipamento Bio-Rad CODA® Automated EIA Analyzer. O kit utilizado foi o Ketamine Micro-Plate EIA – Forensic Application da OraSure Technologies, Inc.. Para os passos da validação, amostras brancas de sangue total e de urina foram fortificadas com diferentes concentrações de KET (210, 300, 510, 3000 ng/mL). Para a avaliação da ocorrência de reatividade cruzada, diferentes amostras foram fortificadas com fenciclidina (10, 100 ng/mL). Resultados e Discussão: Para validar a técnica analítica, foram avaliados os seguintes parâmetros: especificidade e seletividade do método (utilizando soluções de ketamina e de fenciclidina, que é um análogo estrutural da primeira), até à comprovação da não ocorrência de arrastamento, passando pela garantia da robustez do método perante a introdução de diversas variáveis. Da realização de todos os testes propostos, surgiu a evidência do desempenho adequado de diversos parâmetros essenciais: o método revelou-se específico/seletivo para a ketamina, foi verificada a ausência de reatividade cruzada com outros compostos (mesmo que estruturalmente semelhantes à KET), não se verificou arrastamento de analito e a robustez do método foi também assegurada através do estudo de diversas variáveis distintas propositadamente introduzidas. Os resultados obtidos na validação permitem concluir que o método se revelou adequado e eficiente para a deteção de ketamina nas amostras testadas (sangue branco, mistura de sangues reais e urina), com um cut-off de 210 ng/mL, quer para sangue, quer para urina, permitindo a sua aplicação na rotina do Serviço de Toxicologia Forense.
- Determinação de GHB em Amostras BiológicasPublication . Castro, André Lobo; Reis, Flávio; Teixeira, HelenaApresentação dos parâmetros de Validação Analítica já estudados no desenvolvimento da técnica de determinação de GHB em amostras biológicas (sangue, urina, cabelo). Serão apresentados os estudos preliminares realizados para o desenvolvimento do método analítico e os resultados de validação obtidos até ao momento no estudo e desenvolvimento da técnica analítica, designadamente, extracção em fase sólida (SPE) e Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa em tandem (GC/MS-MS).
- GHB Detection in biological samples by GC‐MS‐MS with forensic purposesPublication . Castro, André Lobo; Reis, Flávio; Teixeira, HelenaApresentação dos parâmetros de Validação Analítica já estudados no desenvolvimento da técnica de determinação de GHB em amostras biológicas (sangue, urina, cabelo). Serão apresentados os resultados de validação obtidos até ao momento no estudo e desenvolvimento da técnica analítica para amostras de sangue, designadamente, extração em fase sólida (SPE) e Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa em tandem (GC/MS-MS). Serão também apresentados os resultados dos testes de extração efetuados para efeitos de desenvolvimento da técnica analítica para amostras de cabelo, designadamente, extração líquido-líquido e Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa em tandem (GC/MS-MS).