Loading...
9 results
Search Results
Now showing 1 - 9 of 9
- Avaliação Direta do Kit Investigator® 26plex QS com outros Kits utilizados na rotina laboratorial do SGBF-CPublication . Cardoso, Paula; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Cunha, Patrícia; Shataskova, Alena; São Bento, Marta; Bento, Ana Margarida; Sampaio, Lisa; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroA identificação individual carece do estudo e caracterização de marcadores polimórficos presentes no ADN, sendo a análise de Short Tandem Repeats (STRs) a metodologia de eleição em Genética Forense. A introdução da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) revolucionou a área forense, dado que permite a obtenção de inúmeras cópias de ADN, através da amplificação de sequências específicas de interesse. O contínuo desenvolvimento científico e o aparecimento de novas metodologias, compele à atualização dos procedimentos laboratoriais implementados, de forma a rentabilizá-los e torná-los mais eficientes. No entanto, a implementação de uma metodologia, num laboratório acreditado, requer uma validação interna que compreende uma análise extensiva a fim de confirmar a sua adequabilidade. A avaliação direta por comparação com métodos desenvolvidos constitui uma fase crucial deste processo. O kit Investigator® 26plex QS, da QIAGEN, assenta numa reação de PCR multiplex, através da amplificação simultânea de 24 STRs, 2 Sensores de Qualidade e Amelogenina. Os Sensores de Qualidade inclusos neste kit de amplificação permitem inferir sobre a qualidade da amostra e o sucesso da reação de PCR, alertando, igualmente, para a presença de inibidores. Com o objetivo de avaliar o kit Investigator® 26plex QS, nomeadamente por comparação direta com as metodologias já implementadas e validadas no SGBF-C, o GlobalFiler™ PCR Amplification Kit e o PowerPlex® Fusion 6C System, foram selecionadas 24 amostras para amplificação (PE-SGBF-C-001 Rev09, Determinação de perfil genético de ADN por PCR/eletroforese capilar a partir de amostras de referência de sangue e saliva – procedimento interno do SGBF-C). A eletroforese capilar realizou-se no sequenciador automático ABI PRISM® 3500 Genetic Analyzer, seguindo-se a análise dos eletroferogramas através do software GeneMapper™ ID-X 1.6. Neste estudo foi possível constatar que os perfis genéticos obtidos com o kit Investigator® 26plex QS são concordantes com os perfis resultantes da análise através das metodologias supramencionadas. Adicionalmente, os dados preliminares deste trabalho evidenciam o potencial deste kit de amplificação e sugerem tratar-se de uma metodologia robusta de análise. Sendo, não obstante, imprescindível a realização de estudos complementares de validação.
- Metodologias para preparação e extração de ADN de fragmentos humanos antigos: uma revisão preliminarPublication . Franco, Magda; Correia Dias, Helena; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO Laboratório de ADN Antigo do Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) tem como objetivo, entre outros, analisar fragmentos humanos antigos (ossos e dentes). Pretende assim, através de análises genéticas, contribuir para estudos relacionados com a evolução de populações antigas humanas, assim como a sua relação com a população atual. A reduzida quantidade de ADN e o elevado nível de degradação são dois dos desafios mais comuns quando se trabalha com ADN antigo (aDNA). É crucial diferenciar o ADN exógeno do aDNA autêntico, visto que estas amostras estão sujeitas a contaminações ambientais e humanas. Tendo em conta a pouca qualidade esperada das amostras, será mais eficaz o estudo do ADN mitocondrial (mtDNA) do que do ADN nuclear, já que o mtDNA está presente nas células num maior número de cópias e apresenta uma configuração molecular circular fechada, que resulta numa maior proteção. Por outro lado, como este ADN é herdado apenas por via materna, o seu estudo não é muito utilizado nas identificações individuais, mas é uma fonte importante de ADN para realizar estudos populacionais, sendo que nos permite obter informações sobre as linhagens maternas dos indivíduos. De acordo com a literatura, os métodos de pré-processamento usados antes da extração de ADN podem afetar a autenticidade e a quantidade de ADN obtido. Várias técnicas de pré-tratamento são utilizadas atualmente, tais como, limpeza da superfície do osso com lixívia, seguido de limpeza com água e, por fim, com etanol. Também é utilizada luz UV para garantir que o ADN extraído será autêntico e não de fontes exógenas. Em análises forenses, os dentes e ossos são normalmente reduzidos a pó para a extração de ADN. Tem sido também demonstrado que é possível obter bons resultados com um método diferente -"scrapping"-, sendo que esta técnica preserva melhor a amostra. No entanto, é necessário avaliar a idade, o estado e o nível de degradação do osso/dente, sendo que amostras frágeis podem ser quebradas facilmente, mesmo com este método. Na fase de extração, existem vários métodos que podem ser usados: métodos baseados em colunas (rápidos,mas produzem pouca quantidade de ADN); e métodos baseados em sílica, precipitação e microfiltros (demorados e trabalhosos, mas produzem melhores resultados). Também existe o método de fenol-clorofórmio (ainda de referência e utilizado por vários anos), que é trabalhoso e envolve riscos para o operador. Em suma, é importante fazer uma revisão dos métodos mais adequados para o tratamento e extração destas amostras difíceis, tendo em conta a manutenção da integridade das mesmas, para que possam ser utilizadas em investigações futuras ou expostas em museus. Assim, esta revisão serve como um primeiro passo para a implementação das metodologias mais adequadas para a obtenção de aDNA autêntico de restos humanos antigos para estudos futuros no Laboratório de ADN Antigo do INMLCF.
- Validação e implementação do painel Precision ID GlobalFilerTM NGS STR v2 em amostras forensesPublication . Catré, Inês; Shastakova, Alena; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Cunha, Patrícia; São Bento, Marta; Bento, Ana Margarida; Sampaio, Lisa; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroO Serviço de Genética e Biologia Forenses do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. da Delegação do Centro (SGBF-C) pretende implementar a metodologia de Next Generation Sequencing (NGS) aplicada a Short Tandem Repeats (STRs) autossómicos. Com esse propósito foi realizado um estudo para validação do painel Precision ID GlobalFilerTM NGS STR panel v2 da Applied Biosystems ThermoFisher Scientific. Esta tecnologia permite realizar a sequenciação de um elevado número de fragmentos de ADN por amostra, levando à determinação de um maior número de alelos por marcador genético, não detetáveis através da metodologia usualmente utilizada para STRs autossómicos no SGBF-C. Antes de realizar a implementação de uma nova metodologia na rotina de um laboratório acreditado é necessário testar e validar o novo método. Neste estudo foram selecionadas várias amostras de processos criminais e de processos de parentesco, previamente analisadas por Eletroforese Capilar (EC), pretendendo-se avaliar o potencial desta nova metodologia, nomeadamente através do aumento do poder de discriminação. Durante todo o procedimento foram seguidas as recomendações da casa comercial para a utilização deste painel, com recurso aos equipamentos HID Ion ChefTM e Ion S5TM System. Após a análise dos resultados com o ConvergeTM Software, e realizando uma comparação com os resultados previamente obtidos para EC, foi possível concluir que o painel de GlobalFiler para NGS traz algumas vantagens em relação ao kit GlobalFiler™ PCR Amplification para EC. No entanto, antes da sua implementação, deverão ser realizados mais alguns estudos complementares de validação.
- ADN antigo: perspetivas e desafiosPublication . Correia Dias, Helena; Franco, Magda; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO DNA antigo (aDNA) pode ser uma fonte crucial de informação para estudos sobre a evolução e história das populações, revelando aspetos importantes, como migrações e interações humanas. Desde o primeiro estudo baseado no isolamento de aDNA, em 1984, novos desafios e oportunidades surgiram na área. Ao longo dos anos, com as melhorias técnicas nos métodos de extração de ADN e a emergência de novas metodologias de sequenciação de alto rendimento, como massive parallel sequencing, foram também impulsionadas novas perspetivas neste campo. Os restos humanos antigos, provenientes de escavações arqueológicas e de coleções museológicas, podem ser difíceis de analisar, principalmente devido à contaminação por ADN moderno, à degradação e exiguidade do aDNA, à contaminação laboratorial, ao armazenamento incorreto, às condições ambientais, entre outros. Além disso, apesar de muitos métodos de pré-tratamento terem sido propostos, poucos estudos relatam a preservação da estrutura e integridade do espécime. Os ossos e dentes são, muitas vezes, a única evidência da existência de um indivíduo ou população e devem ser analisados, mas essencialmente preservados. A análise de aDNA consiste, resumidamente, na preparação da amostra (usando, preferencialmente, um método não invasivo), extração de ADN, quantificação de ADN, PCR e sequenciação. O processo de preparação da amostra é determinante devido às características particulares do aDNA, como a baixa quantidade e a extensa degradação. Uma das questões mais importantes é a autenticidade do aDNA, sendo essencial minimizar o risco de contaminação por ADN moderno. Na extração de ADN, considerando amostras museológicas, é necessário selecionar um método não destrutivo, seguido de um método de quantificação preciso, que permita também otimizar a extração e detectar inibidores da PCR. A PCR deve também ter características específicas, comparando com a amplificação tradicional. Uma PCR dividida em dois passos é essencial para ultrapassar os artefactos do aDNA degradado. É aconselhável fazer múltiplas reações de PCR da mesma amostra e depois sequenciar as réplicas por sequenciação de Sanger. Após alinhamento e comparação das múltiplas sequências, a sequência de interesse é obtida. Recentemente, o Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro (SGBF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) criou um Laboratório de ADN Antigo com o objectivo principal de estudar amostras arqueológicas com diferentes intervalos post-mortem. Considerando que a análise de aDNA desempenha um papel crucial nos estudos arqueológicos e paleogenómicos, o objectivo da presente comunicação é divulgar e partilhar na comunidade científica o nosso novo Laboratório de ADN Antigo do INMLCF e mostrar o seu potencial para a expansão da investigação em aDNA, sendo que este laboratório está integrado num projecto científico que estuda comunidades da pré-história recente, na região centro de Portugal (MEDICE II).
- Exposição a radiação ultravioleta - qual o impacto na amplificação de STRs pelo Investigator® 26Plex QS?Publication . Cardoso, Paula; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, Francisco; Brito, PedroA análise de amostras problema com dois ou mais contribuintes reveste-se de especial dificuldade, pelo que é necessária a utilização de um kit de amplificação robusto e com elevada sensibilidade. O Investigator 26Plex QS da Qiagen permite a obtenção de um perfil completo para concentrações de 0,1 ng de ADN – Low Template DNA. Contudo, esta capacidade de analisar ínfimas quantidades de material biológico constituiu-se igualmente como uma limitação ao permitir a deteção de contaminações residuais. Por conseguinte, é fulcral instaurar medidas preventivas que acautelem esta ocorrência. A radiação ultravioleta (UV) provoca na molécula de ADN alterações morfológicas, das quais a com maior impacto se deve à ocorrência de dímeros de timina que, ao impedirem o acoplamento da Taq polimerase à cadeia molde, impossibilitam a amplificação dos fragmentos de ADN. O presente trabalho teve como principal objetivo aferir a performance do kit Investigator 26Plex QS na amplificação de amostras submetidas a radiação UV. Com este propósito, prepararam-se 5 alíquotas com 10 μL de produto extraído por Prep-n-Go, provenientes de uma amostra segura, à concentração de 1,5 ng/μL. As 5 alíquotas foram expostas a irradiação UV durante 2, 5, 10, 15 e 20 minutos respetivamente e, de seguida, amplificadas. Similarmente, uma mancha de sangue adequadamente impregnada - com sensivelmente 125 μl de sangue - foi colocada sob irradiação durante o mesmo período. A cada intervalo realizou-se um punch de 0,5 mm, seguindo-se extração pela mesma metodologia. Os resultados obtidos permitiram verificar que para uma mancha de sangue preservada em cartão FTA, o efeito da radiação não é particularmente significativo, averiguando-se que mesmo após o período de exposição mais elevado, foi possível uma adequada análise do perfil genético obtido. Este resultado poderá dever-se às propriedades químicas dos cartões FTA que possibilitam uma adequada preservação do material biológico. Pelo contrário, no caso do produto extraído, verificou-se uma queda substancial dos alelos com tamanho superior a 214 pb, imediatamente a partir dos 2 minutos. A cada período, verificou-se uma redução na intensidade dos alelos detetados, assim como no número de marcadores genotipados. Na amostra sujeita a radiação UV durante 20 minutos foi ainda possível identificar dois alelos de dois diferentes marcadores. Não obstante, a deteção de dois alelos provenientes de uma possível contaminação na câmara de trabalho poderia comprometer a interpretação de um perfil de mistura, reiterando a importância de higienizar a workstation antes e após a sua utilização. Em suma, este kit de amplificação devido à sua elevada robustez, permitiu a identificação de dois alelos aquando da exposição a UV durante 20 minutos, pelo que, de forma a evitarem-se contaminações pontuais, o procedimento laboratorial deverá ser precedido e seguido pela descontaminação das superfícies, camaras de trabalho e material utilizado, por pelo menos 20 minutos.
- A implementação de um sistema de PCR em multiplex na identificação de amostras forenses em diferentes substratos - kit Investigator 26Plex QSPublication . Cardoso, Paula; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroA individualidade humana concede a cada individuo uma personalidade jurídica e uma identidade pessoal. Esta unicidade possibilita a identificação humana que constitui-se como o alicerce da Genética e Biologia Forenses, que compreende o estudo e caracterização de marcadores polimórficos de ADN (Ácido Desoxirribonucleico), designados Short Tandem Repeats (STRs). Dado que a perícia produzida por esta área científica apresenta um elevado poder probatório, impõem-se uma atualização dos procedimentos implementados, visando incrementar a confiabilidade dos resultados obtidos. O presente projeto teve como propósito avaliar a adequabilidade do kit Investigator® 26Plex QS, Qiagen, à casuística do laboratório Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro do INMLCF, I.P., por meio de uma validação interna extensiva que visou a sua posterior implementação. Com este trabalho pretendeu-se relatar os procedimentos e parâmetros utilizados no decurso da validação interna deste ensaio, que encalçaram diretrizes internacionais da SWGDAM, assim como expender os resultados obtidos. Primeiramente, houve a necessidade de fixar critérios únicos de análise que permitissem validar e interpretar os perfis genéticos obtidos nos ensaios subsequentes. De seguida, pretendeu-se aferir o desempenho do kit, verificando a sua concordância com metodologias normalizadas no SGBF-C e avaliando a sua sensibilidade, especificidade, robustez e precisão. Complementarmente, foram efetuadas alterações ao protocolo original, nomeadamente redução de volume e amplificação direta, com vista a obter uma metodologia protocolar otimizada à rotina laboratorial. Este estudo compreendeu a análise de amostras biológicas provenientes de variados substratos, incidindo-se o estudo sobre amostras problema, de referência e amostras simuladas. O procedimento geral incluiu a extração de ADN, seguindose a sua quantificação, quando necessária, e, posterior amplificação pelo kit Investigator® 26plex QS. A eletroforese capilar realizou-se no sequenciador automático Applied Biosystems™ 3500 Genetic Analyzer, sendo a análise dos eletroferogramas efetuada no software GeneMapper™ ID-X 1.6.. Com este trabalho foi possível caracterizar as principais vantagens do kit Investigator® 26plex QS, assim como as suas limitações. Demonstrando-se que este kit de amplificação de ADN humano evidencia elevada robustez, confiabilidade, especificidade e sensibilidade, que permite a obtenção de um perfil genético completo com apenas 15 células humanas (1 ng de ADN).
- O efeito de inibidores na amplificação de STRs autossómicos pelo kit Investigator® 26Plex QSPublication . Cardoso, Paula; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroA metodologia de PCR – reação em cadeia de polimerase – constitui-se como a metodologia de eleição na análise de amostras biológicas em Genética e Biologia Forenses. O material genético colhido em cenas de crime ou em cadáveres encontra-se frequentemente exposto ao meio ambiente e/ou a diferentes inibidores, levando a uma ineficiente amplificação dos marcadores genéticos. De entre os inibidores mais frequentemente encontrados em amostras problema incluem-se: etanol, índigo-carmim, solo argiloso, solo humoso e folhagem. Os mecanismos de ação destes inibidores contemplam uma ineficiente lise celular que impossibilita a ação da Taq polimerase e a extensão da cadeia nucleotídica. Em particular, o solo age como fator de inibição e de degradação, dado que os seus componentes minerais se ligam às partículas de ADN e alteram a conformação da molécula. Adicionalmente as plantas e microrganismos presentes no solo utilizam o material biológico depositado como fator de crescimento, degradando-o. Por conseguinte, verifica-se uma amplificação preferencial de alelos de menor dimensão e a ocorrência de drop-out alélico. Para aferir a capacidade do kit Investigator 26Plex QS da Qiagen, em produzir resultados válidos e interpretáveis na presença dos inibidores supramencionados, prepararam-se amostras simuladas a diferentes proporções Inibidor vs ADN, nomeadamente 1:10, 1:1 e 10:1. Para a conceção das soluções de inibidores utilizou-se solução stock de etanol a 70%, preparou-se uma solução de índigo-carmim a 12mM e no que diz respeito, à folhagem, solo argiloso e solo humoso, 1g de cada inibidor foi adicionado a aproximadamente 2mL de água nuclease free para a obtenção de uma mistura homogénea. Após a preparação das amostras simuladas compostas por ADN controlo e solução inibitória, estas foram introduzidas num lote de amostras não contaminadas para se averiguar a capacidade do kit manter o seu adequado desempenho e para determinar o quão informativos são os controlos de qualidade incluídos neste. Com este trabalho foi possível demonstrar que para as proporções 1:10 e 1:1, é possível obter perfis genéticos completos com elevada intensidade de fluorescência e sem o aparecimento de artefactos. Contudo, para concentrações elevadas de inibidor - em que o input máximo de ADN era 0,1 ng - verificou-se uma redução abruta na performance do kit de amplificação com drop-out alélico dos STRs de maior tamanho. Complementarmente, através deste ensaio verificou-se que os controlos de qualidade inclusos no kit da Qiagen não permitiram aferir pela presença de inibidores nas amostras, observando-se resultados similares entre as amostras simuladas e as do grupo controlo. Atendendo que a extração de ADN remove uma quantidade elevada de material exógeno de uma amostra, a concentração de inibidores aquando da amplificação será mais reduzida. Por conseguinte, os resultados deste trabalho demonstram que este kit de amplificação permite a obtenção de um perfil genético válido e robusto.
- Implementação do laboratório de virologia e análises clínico forenses na Delegação do Centro do INMLCFPublication . Cainé, Laura; Balsa, Filipa; Amorim, António; Corte Real, F.; Rodrigues, J.; Monfreitas, V.; Brito, Pedro
- Internal Validation of the Investigator 26Plex QS Amplification Kit: a high-throughput multiplex assay for reference and low copy number DNA samplesPublication . Cardoso, Paula; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virginia; Dario, Rita; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroThe Investigator® 26plex QS Amplification Kit, from QIAGEN, provides reliable and rapid DNA profiles while enabling the multiplex amplification of 24 STRs, 2 Quality Sensors and a gender-determining marker, Amelogenin. The Quality Sensors incorporated in this kit provide insight into the sample quality and the PCR's success while alerting to the presence of inhibitors. Through an extensive internal validation study, this research sought to implement the Investigator® 26plex QS in the laboratory routine of the Forensic Genetic and Biology Service, Central branch (SGBF-C) of the Portuguese National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences. Here we detail the procedures and parameters applied which followed the SWGDAM guidelines, as well as report the results obtained throughout. Firstly, it was crucial to establish unique analytical criteria that would be the baseline for the interpretation of the results obtained. To accomplish such, analytical, stochastic, heterozygous balance and stutter thresholds were defined. Thereupon, this study intended to gauge the kit’s performance, by evaluating its concordance with normalized methodologies while assessing its sensitivity, specificity, robustness, and precision, besides its efficiency in the presence of degraded and/or inhibited samples. Lastly, in favour of optimizing the laboratory workflow, an assay was carried out to test half volume reactions and direct amplification on reference samples. In this study a wide range of sample types were analysed, which made it possible to acquire robust data pertaining to the performance of the assay. The laboratory methodology applied comprehended: DNA extraction using Prep-n-Go™ Buffer and PrepFiler Express™ Forensic DNA Extraction Kit, quantification with the Quantifiler™ Trio Quantification Kit, followed by the amplification with the Investigator® 26plex QS. Capillary electrophoresis was performed in the Applied Biosystems™ 3500 Genetic Analyzer, and the electropherograms’ were analysed using the GeneMapper™ ID-X Software v1.6. Through this work, it was possible to characterize the main advantages of the Investigator® 26plex QS kit, as well as its limitations. The validation data demonstrated that this system produces reliable profiles in the presence of minute DNA quantities and identifies the minor contributor in a mixture up to a 1:50 ratio. The results inferred a high human specificity, robustness, and sensitivity, while producing concordant and reproducible results with optimized protocols for both reference and low copy number DNA samples. Through concordance studies it was further shown that there is a high consistency between this novel amplification kit and those currently implemented in the SGBF-C, thus proving its suitability for the analysis of forensic samples.