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- LC-MS/MS-MS3 for determination and quantification of ∆9-tetrahydrocannabinol and metabolites in blood samplesPublication . Proença, Paula; Martinho, Beatriz; Teixeira, Helena; Monteiro, Carla; Simões, Susana; Franco, João; Corte Real, F.Due to the high prevalence of cannabinoids in forensic toxicology, it is crucial to have an efficient method that allows the use of a small sample amount and that requires a minimal sample preparation, for the determination and quantification of low concentrations. A simple, highly selective and high throughput liquid chromatography tandem mass spectrometry method (LC-MS/MS-MS3) was developed for the determination and quantification of ∆9-tetrahydrocannabinol (THC), 11-hydroxy-∆9-THC (THC-OH) and 11-nor-∆9-THC-9-carboxylic acid (THC-COOH) in blood samples. Chromatographic analysis was preceded by a protein precipitation of 0.1 mL of blood samples with acetonitrile, then THC, THC-OH, THC-COOH and deuterated internal standards were separated on an Acquity UPLC® HSS T3 (100 mm x 2.1 mm i.d., 1.8 mm) reversed-phase column using a gradient elution with 2 mM aqueous ammonium formate (0.1% formic acid) and methanol, at a flow rate of 0.4 mL/min, and with a run time of 10 min. For MS/MS-MS3 analysis, a SCIEX QTRAP® 6500+ linear ion trap triple quadrupole mass spectrometer was used via electrospray ionization (ESI), operated in multiple reaction mode (MRM) and linear ion trap mode (MS3). The method was validated in accordance with international accepted criteria and guidelines. The method was selective and linear between 0.5-100 ng/mL (r2>0.995). The lower limits of quantification (LLOQ) corresponded to the lowest concentrations used for the calibration curves. The coefficients of variation obtained for accuracy and precision were less than 15%. The mean recoveries were between 88.0-101.4% for the studied concentration levels (1 ng/mL, 5 ng/mL and 50 ng/mL). No significant interfering compounds, matrix effects or carryover were observed. The validated method provides a sensitive, efficient and robust procedure for the quantitation of cannabinoids in blood using LC–MS/MS-MS3 and a sample volume of 0.1 mL. This work is also a proof of concept for using LC-MS3 technique to determine drugs in biological samples.
- Análise do trabalho desenvolvido durante o primeiro ano da Unidade de Base de Dados de Perfis de ADNPublication . Bogas, Vanessa; Cardoso, Paula; Bento, Ana; Real, F. Corte; Brito, PedroIntrodução : A 1 de janeiro de 2023 à Unidade de Base de Dados de Perfis de ADN (BDADN) iniciou funções assumindo, para além da gestão do software responsável pelo armazenamento de perfis genéticos, a inserção de perfis genéticos e respetivos dados, a análise e comunicação de coincidências e resposta a solicitações de dados pessoais e processuais, a administração de todas as restantes solicitações dirigidas ao Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF), a nível nacional, no âmbito da Base de Dados de ADN, como por exemplo, pedidos de colheita e inserção, até então sob a responsabilidade do Serviço de Genética e Biologia Forenses. A BDADN é certificada pela NP EN ISO 9001:2015, desde o início de 2022, pelo que, a toda a responsabilidade anteriormente descrita, acresce também a manutenção dos requisitos de qualidade exigidos por esta norma. Com este estudo pretende-se fazer uma caracterização geral do trabalho desenvolvido por esta Unidade, durante o primeiro ano de atividade, especialmente no que diz respeito a comunicações com entidades externas e internas ao INMLCF. Material e Métodos: Para a realização deste estudo, foi feito o levantamento dos processos criados no software de gestão documental EdocLink, entre 1 de janeiro e 31 de dezembro de 2023, particularizando as solicitações recebidas de autoridades judiciárias nacionais, provenientes de outras entidades no âmbito de cooperações internacional, precedentes dos laboratórios, e ainda todas as comunicações enviadas aos laboratórios e autoridades judiciárias, no período acima referido. Posteriormente, com recurso ao software Excel, os dados foram analisados permitindo fazer uma avaliação do trabalho desenvolvido da BDADN, afetos às tarefas anteriormente referidas, durante o ano de 2023. Resultados e Discussão Após a análise dos dados verifica-se que, durante o ano de 2023, foram criados 7578 processos em EdocLink no contexto dos quais foram recebidas 8762 solicitações das diversas entidades acima referidas, resultando em 9061 comunicações efetuadas. Com o intuito de avaliar o volume de trabalho no contexto referido, foi calculado um valor médio mensal, resultando aproximadamente em 730 solicitações recebidas e 755 comunicações efetuadas. Conclusões :Esta análise permitiu verificar um incremento acentuado do trabalho desenvolvido pela Base de Dados de Perfis de ADN, desde a criação desta Unidade. Este facto deve-se não só á centralização na BDADN de todo o expediente relacionado com a Base de Dados de Perfis de ADN, anteriormente gerido pelos três laboratórios do SGBF, mas também a diversas ações de sensibilização desenvolvidas junto às autoridades judiciárias com o intuito de sensibilizar para a importância do envio de todas as solicitações para esta Unidade. A gestão concertada demonstrou-se eficiente, porém desafiante, e após o balanço do primeiro ano é possível afirmar que o propósito a que a BDADN se dispôs a cumprir foi realizada com sucesso, consciente, no entanto, dos desafios futuros face à exigência e responsabilidade do trabalho desempenhado, bem como do impacto deste, a nível nacional.
- Forensic genetic analysis of South Portuguese population with the six dye Powerplex® Fusion 6CPublication . Vieira Da Silva, Cláudia; Afonso Costa, Heloísa; Porto, Maria João; Cunha, E; Corte Real, F.; Amorim, AntónioAs an improvement in efficiency and in Human Discrimination Power, the new six dye multiplex kit PowerPlex® Fusion 6C System, by Promega, available for human identification can co-amplify 27 loci, in a single reaction, have been introduced in the last years with great success. This kit allows the amplification and detection of autosomal loci included in the expanded Combined DNA Index System CODIS, plus the loci Penta D, PENTA E and SE33 as well as Amelogenin for gender determination. Furthermore, this kit includes three Y –STRs (DYS391, DYS576 and DYS570), allowing allelic attribution in a total of 27 loci. This genetic markers extension satisfies not only CODIS but also European Standard Set recommendations. Thinking about continuous human migration movements, especially in a very cosmopolitan region like Lisbon and south of Portugal, and also, in keeping population studies and actualized STR databases we decided to update our previous studies. Our sample is composed of 600 unrelated individuals, from paternity testing with laboratory identity anonymised. DNA was extracted by Prep-n-go BufferTM(Thermo-Fisher Scientific). PCR amplification was performed with PowerPlex® Fusion 6C System, according to manufacturer’s guidelines. Fragment analysis was carried out in an Applied Biosystems® 3500 Genetic Analyser. Electrophoresis results were analysed with GeneMapper® ID-X v1.4. Allele frequencies and population statistics, including Hardy-Weinberg equilibrium p-values from exact test probabilities and forensic parameters were calculated with adequate software. In conclusion, our population information was updated in order to apply most recent data in our casework weight of evidence.
- Investigação de parentesco biológico: a importância de marcadores adicionais em casos de especial complexidadePublication . Rodrigues, Diogo; Vieira Da Silva, Cláudia; Carvalho, Mónica; Afonso Costa, Heloísa; Sampaio, Lisa; Cunha, E; Corte Real, F.; Amorim, AntónioA grande maioria das perícias de investigação de parentesco biológico realizadas pelo Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) têm inicio com a ordem do Tribunal para realização da mesma. O mais frequente é o Tribunal dar ordem para nos serem presentes, como intervenientes, um trio constituído por um suposto pai, uma mãe e um(a) filho(a), havendo, no entanto, variações quanto ao número ou tipo de intervenientes, o que pode resultar em maior dificuldade em apresentar resultados com a robustez desejada. Em qualquer dos casos, genericamente, as conclusões possíveis de um estudo de parentesco biológico e mais concretamente de um estudo de paternidade são a exclusão ou não exclusão de paternidade relativamente ao suposto pai em estudo. A conclusão pela não exclusão é sempre acompanhada pela valorização estatística dos resultados, designadamente através do cálculo e apresentação do Índice de Parentesco (IP) e da Probabilidade de Parentesco (W). No caso de uma perícia de investigação de parentesco em que nos seja presente unicamente um filho biológico do suposto pai e um suposto filho biológico, sem possibilidade de estudo das amostras das respetivas mães biológicas nem da amostra biológica do suposto pai, e nos é pedido o estudo sobre a possibilidade de ambos serem filhos biológicos do mesmo pai, a impossibilidade de exclusão da paternidade pode estar associada a valores calculados de IP que podem ser pouco robustos. O ensaio Investigator® HDplex permite o estudo de marcadores genéticos adicionais aos habitualmente estudados na rotina pericial do INMLCF.
- The role of DNA concentrations in forensic casework results : regression models applicationPublication . Vieira Da Silva, Cláudia; Amorim, António; Afonso Costa, Heloísa; Porto, Maria João; Corte Real, F.; Antunes, MariliaIn forensic DNA typing, short tandem repeats (STRs) are the most frequently genotyped markers in order to distinguish between individuals and to relate them to a crime or to exonerate the innocent. In recent years, new controversies have arisen with the advent of more sensitive techniques, allowing profiles to be recovered from minimum amounts of DNA, hence, bringing challenges to weight of evidence evaluation for forensic DNA profiles obtained from low template DNA samples. Introduction of interpretation models, or even new weight of evidence software should be accompanied by a measure of uncertainty that is part of any biological analysis. Specially, due to stochastic effects, the reliability of the obtained profiles might differ between machinery, workflow and also PCR settings in use in different laboratories. In this work we try to understand the relation between Peak Area, DNA concentration and also size marker, using adequate regression models. Buccal swabs from 180 individuals, with unknown identity, were selected for this study. DNA was extracted with prep-n-go™ buffer and quantified using Quantifiler® Trio DNA Quantification kit in a 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). STR amplification was performed with Powerplex Fusion 6C amplification kit (Promega). Amplified PCR products were separated and detected in an Applied Biosystems® 3500 Genetic Analyzer using manufacturer’s conditions. Electrophoresis results were analysed with GeneMapper® ID-X v1.4. Statistical analysis was performed with R Studio. Our results allow having an important overview about the relation between DNA concentrations, peak area, and size of the studied genetic markers.
- Got her mummy´s eyes: Eye color investigation using IrisPlex – preliminary studyPublication . Dario, Paulo; Rita Olivera, Ana; Ribeiro, Teresa; Lucas, Isabel; Marques, Manuela; Porto, Maria João; Costa Santos, Jorge; Corte Real, F.; Dias, DeodáliaSNP phenotypic markers are being studied by several groups worldwide. As a result, phenotypic loci such as the ones responsible for human eye, hair and skin color are starting to get known. These may provide information for identification of unknown sample donors in criminal casework when there are no suspects. This kind of information may be even more relevant when the sample donor possesses phenotypic characteristics which distinguish him from the population in which he is inserted. Nevertheless, this approach may be used in similar scientific areas. In this work, a DNA sample from a mummified corpse with historical and scientific interest was studied in order to discover more information about who this corps belonged to. One of the tools used in this investigation was IrisPlex, designed for eye color prediction. This study presents one example on how this methodologies may be useful, not only in forensic investigation but also in areas such as physical anthropology.
- Mortality due to respiratory infections: an alert study before COVID-19 pandemicPublication . Gi, Andreia; Henriques de Gouveia, Rosa; Corte Real, Francisco; Carvalho, LinaObjective. Respiratory tract infections remain a common problem in clinical practice with high morbidity and mortality worldwide. In Portugal, pneumonia was the third leading death cause in 2018. Due to COVID-19 pandemic, there is a growing concern about the burden of respiratory diseases and preventable risk factors. The present study started before the pandemic and its aim was to determine the occurrence of pneumonia/bronchopneumonia in a postmortem series and to characterize its circumstantial context. Methods. A retrospective anatomopathological study was performed on cases with acute pneumonia/bronchopneumonia at the Medicolegal Portuguese Institute (2011-2017). Results. In an autopsy series of 737 patients, 521 were male and 675 presented comorbidities. The mean age was 63.87 ± 19.8 years. The most common acquisition site was community (65.1%), as natural death (65.5%). Concerning the manner of death, most cases (48.0%) were sudden deaths, followed by accidents (29.2%). A statistically significant association was observed between the medicolegal etiology and the place of infection acquisition, with higher prevalence of natural obitus (91.0%) in community-acquired pneumonia/bronchopneumonia versus higher prevalence of violent obitus in hospitalacquired pneumonia/bronchopneumonia (82.1%) (p < 0.001). Conclusions. Forensic anatomopathological postmortem data may contribute to better understand community and hospital pulmonary infections.
- Challenges and (Un)Certainties for DNAm Age Estimation in FuturePublication . Correia Dias, Helena; Cunha, E; Corte Real, F.; Manco, LicínioAge estimation is a paramount issue in criminal, anthropological, and forensic research. Because of this, several areas of research have focused on the establishment of new approaches for age prediction, including bimolecular and anthropological methods. In recent years, DNA methylation (DNAm) has arisen as one of the hottest topics in the field. Many studies have developed age- prediction models (APMs) based on evaluation of DNAm levels of many genes in different tissue types and using different methodological approaches. However, several challenges and confounder factors should be considered before using methylation levels for age estimation in forensic contexts. To provide in-depth knowledge about DNAm age estimation (DNAm age) and to understand why it is not yet a current tool in forensic laboratories, this review encompasses the literature for the most relevant scientific works published from 2015 to 2021 to address the challenges and future directions in the field. More than 60 papers were considered focusing essentially on studies that developed models for age prediction in several sample types
- Sudden cardiac death and valvular pathologyPublication . Henriques de Gouveia, Rosa; Corte Real, FranciscoSudden death due to valvular heart disease is reported to range from 1% to 5% in native valves and around 0.2%-0.9%/year in prosthesis. The nature of the diseases is varied, from heritable, congenital to acquired. It may affect both genders in multiple age groups. The authors show and comment examples of the major nosologic aetiologies underlying unexpected exitus letalis of valvular nature.
- Deteção de esforço reduzido com os subtestes de Memória de Dígitos e vocabulário (WAIS-III) numa amostra com traumatismo cranio-encefálico examinada em contexto médico-legalPublication . Pedrosa, Sílvia; Simões, Mário R.; Barreto, Margarida B.; Fonseca, Mónica; Mestre, António; Sousa, Liliana B.; Cruz, Isabel; Gaspar, Helena; Costa, Graça; Corte Real, F.A utilidade dos indicadores de esforço reduzido provenientes de testes psicológicos comummente utilizados, como é por exemplo o caso dos instrumentos de exame da inteligência, tem sido reconhecida no âmbito da avaliação neuropsicológica forense. Neste contexto, e com o objectivo de analisar a relevância dos subtestes Memória de Dígitos e Vocabulário da WAIS¬III, foi realizado um estudo comparativo dos desempenhos de um grupo de 40 litigantes com Traumatismo Crânio Encefálico examinados em contexto médico-legal (grupo experimental) e um grupo de 30 sujeitos da população geral (grupo controlo), equiparados quanto às variáveis sócio-demográficas. Os resultados obtidos sugerem a necessidade de alguma prudência na utilização agregada dos indicadores de esforço reduzido derivados dos subtestes da WAIS-III, estando a sua validade e utilidade dependentes do recurso adicional a provas específicas de enviesamento de resposta negativa (Test of Memory Malingering, Rey 15-Item Test e escalas LI, AM e NI do Structured Inventory of Malingered Symptomatology). Em sujeitos com TCE, é indicada a potencial utilidade de um ponto de corte inferior a 7 na "Pontuação total bruta da Memória de Dígitos" como referência associada à presença de eventuais comportamentos de "esforço reduzido".