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- Implementação da deteção molecular de SARS-CoV-2 na Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências ForensesPublication . Fadoni, Jennifer; Magalhães, Jéssica; Cerqueira, Joana; Cainé, Laura; Amorim, AntónioA Doença do Coronavírus 2019, causada pelo vírus SARS-CoV-2, foi classificada como uma pandemia pela OMS em 11 de março de 2020. Até julho de 2023, foram registados mais de 768 milhões de casos, com mais de 6,9 milhões de mortes associadas. O objetivo do Laboratório de Virologia e de Análises Clínicas e Forenses da Delegação do Norte (LVACF-N) foi implementar a análise de deteção molecular de SARS-CoV-2 na Delegação do Norte do INMLCF, pois a deteção de casos de infeção por SARS-CoV-2 é de extrema importância para controlar a transmissão da infeção, o que por sua vez permite minimizar o impacto da COVID-19 na população e na demanda dos serviços públicos de saúde. A implementação da deteção molecular de SARS-CoV-2 na Delegação do Norte foi dividida em três etapas: i) Validação da metodologia de análise no equipamento de RT-PCR presente na Delegação do Norte, utilizando primers desenhados in house; ii) Avaliação do limiar de deteção do genoma viral; e iii) Validação do novo equipamento de RT-PCR adquirido para o LVACF-N, utilizando um kit comercial e também primers desenhados in house. Na fase I, foram realizadas análises de deteção molecular de SARS-CoV-2 em 61 zaragatoas nasofaríngeas colhidas post-mortem, utilizando primers desenhados in house. Os resultados foram comparados aos resultados de uma entidade externa, e foram obtidos valores de sensibilidade e especificidade iguais a 100%. Na fase II, foi possível detetar o genoma viral com uma concentração ínfima de 0,25 cópias/uL. Na fase III, foi avaliada a reprodutibilidade da análise no RT-PCR CFX96™ System em 30 amostras, utilizando primers desenhados in house e um kit comercial. Os resultados foram comparados aos resultados do equipamento validado na fase I, e não foi encontrada nenhuma divergência. Após a validação dos métodos e dos equipamentos, as análises de deteção molecular de SARSCoV- 2 em amostras colhidas post-mortem pelo Serviço de Clínica e Patologia Forense da Delegação do Norte, passaram a ser realizadas pelo LVACF-N. Entre 31/03/2023 e 21/07/2023, foram processadas 261 amostras, das quais 245 (93,87%) apresentaram resultado “negativo”, 12 (4,60%) “positivo” e 4 (1,53%) “indeterminável”; 177 (67,82%) foram colhidas em cadáveres do sexo masculino, 82 (31,42%) do sexo feminino, e 2 (0,76%) em cadáveres cujo sexo não foi identificado. A média de idade dos indivíduos foi de 63,25 anos, com valores entre 2 e 96 anos de idade. Em um curto intervalo de tempo, o LVACF-N validou metodologias e equipamentos, o que permitiu que as análises de deteção molecular de SARSCoV- 2 em amostras colhidas post-mortem pelo Serviço de Clínica e Patologia Forense desta Delegação, passassem a ser processadas internamente. Assim sendo, o LVACF-N aumentou a capacidade de autossuficiência do INMLCF, reduziu custos, possibilitou um maior aproveitamento de recursos, e pavimentou o caminho para a realização de outros tipos de análises de deteção molecular, a serem realizadas pelo LVACF-N num futuro próximo.
- In house Real-Time PCR multiplex for simultaneous detection of human influenza A and B virus and respiratory syncytial virusPublication . Fadoni, Jennifer; Cainé, Laura; Rodrigues, Joana; Mofreita, Vânia; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Corte Real, F.; Amorim, António
- Hepatitis A: Ultrasensitive enzyme-linked fluorescence assay in occasional detection of prior contact in a medico-legal sample In LisbonPublication . Mofreita, Vânia; Cainé, Laura; Rodrigues, Joana; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Fadoni, Jennifer; Corte Real, F.; Amorim, António
- Next Generation Sequencing for variant detection of SARS-CoV-2 in a medico-legal context in the second year of the PandemicPublication . Rodrigues, Joana; Cainé, Laura; Mofreita, Vânia; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Fadoni, Jennifer; Corte Real, F.; Amorim, António
- Envio de amostras ao SGBF e LV-ACF: colheita, identificação, acondicionamento e transportePublication . Cerqueira, Joana; Matos, Paula; Pereira, Maria João; Fadoni, Jennifer; Amorim, AntónioO presente trabalho tem por objetivo fornecer uma instrução que permita uniformizar os procedimentos a serem realizados por entidades externas ao Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) e ao Laboratório de Virologia e Análises Clínicas e Forenses (LV-ACF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, no que diz respeito à colheita, identificação, acondicionamento e envio de amostras. O âmbito desta instrução aplicar-se-á essencialmente aos Serviços de Clínica e Patologia Forenses e respetivos Gabinetes Médico-Legais e Forenses, envolvidos na amostragem da maioria das amostras. As amostras colhidas poderão ser de referência ou problema, e estar incluídas em processos de investigação de parentesco, investigação individual ou criminalística biológica, em curso no SGBF. As amostras dirigidas ao LV-ACF estão envolvidas nas várias valências dos exames de análises clínicas como Hematologia, Química Clínica, Imunologia, Microbiologia e Genética Humana. A colheita, identificação, acondicionamento e transporte das amostras, assegurando a respetiva cadeia de custódia, é essencial na obtenção e validação dos resultados periciais. Esta apresentação divulgará toda a informação necessária de uma forma clara e apelativa de forma a sensibilizar todas as partes envolvidas. Não se pretende uma descrição exaustiva de um procedimento, mas apenas um esquema prático e simples que facilite a divulgação dos conhecimentos de forma útil.
- Deteção molecular de infeções virais respiratórias na Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências ForensesPublication . Fadoni, Jennifer; Cainé, Laura; Amorim, AntónioOs testes moleculares desempenham um papel crucial na deteção precoce e no controle de infeções virais. No contexto forense, os testes moleculares de deteção viral são de extrema importância, pois permitem a identificação precisa de infeções virais que podem ter contribuído para a morte de um indivíduo. Esse diagnóstico post-mortem é crucial não apenas para determinar a causa da morte em casos suspeitos ou em surtos de doenças, mas também para proteger os profissionais que manipulam os corpos, garantindo que medidas de biossegurança adequadas sejam adotadas. Além disso, os resultados desses testes fornecem dados valiosos para a vigilância epidemiológica, ajudando a monitorar a disseminação de doenças e a implementar estratégias de saúde pública eficazes. O Laboratório de Virologia e de Análises Clínicas e Forenses (LV-ACF) da Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) realiza testes de deteção molecular do vírus de SARS-CoV-2 em amostras colhidas post-mortem de todos os cadáveres cuja autópsia é realizada pelo Serviço de Clínica e Patologia Forense da Delegação do Norte (SCPF-N) do INMLCF. O objetivo desse trabalho é apresentar e analisar os dados referentes aos testes de deteção viral realizados pelo LV-ACF ao longo de um ano, visando contribuir para a melhoria das estratégias de prevenção e controle de doenças virais. Entre 15/06/2023 e 15/06/2024, o LV-ACF da Delegação do Norte do INMLCF realizou 1113 testes de deteção molecular de material genético viral, a partir de zaragatoas nasofaríngeas colhidas post-mortem pelo SCPF-N, nomeadamente 741 testes de deteção molecular de SARS-CoV-2, dos quais 32 (4,32%) apresentaram resultado positivo e 24 (3,24%) apresentaram resultado indeterminável; 124 de deteção molecular de Gripe A, Gripe B e Vírus Sincicial Respiratório, dos quais 5 (4,03%) apresentaram resultado positivo para Gripe A. Não foi detetado nenhum caso de gripe B ou Vírus sincicial respiratório. A idade média dos indivíduos testados foi de 62 anos, com idades compreendidas entre 14 a 96 anos. Relativamente aos casos com resultado positivo, a idade média dos indivíduos com resultado positivo para SARS-CoV-2 foi de 67 anos, com idades compreendidas entre 25 e 95 anos. Em relação aos casos de Gripe A, a idade média dos indivíduos foi de 60 anos, com idades compreendidas entre 31 e 75 anos. Este amplo intervalo etário indica que as infeções virais não se restringiram a uma faixa etária específica, afetando tanto indivíduos jovens quanto idosos. O trabalho realizado pelo LV-ACF é fundamental para a vigilância epidemiológica, ajudando a identificar padrões de infecção e a orientar políticas de saúde pública. Além disso, fornece dados essenciais para a proteção dos profissionais de saúde e a implementação de medidas preventivas eficazes, especialmente em populações vulneráveis. A continuidade desses testes é crucial para uma resposta rápida e informada a surtos de doenças virais.
- Implementação da autópsia molecular utilizando Sequenciação de Nova Geração (NGS) no Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências ForensesPublication . Fadoni, Jennifer; Shastakova, Alena; Cainé, Laura; Santos, Agostinho; Amorim, AntónioA morte súbita cardíaca (MSC) pode ser causada por diversas patologias cardíacas, e na população jovem, geralmente é causada por cardiomiopatias e arritmias, que possuem uma base genética. Nestes casos, o indicado é que sejam realizados testes genéticos post-mortem, também conhecidos como autópsia molecular, cujo objetivo é identificar a causa genética que levou à morte. A sequenciação de nova geração (NGS) permite a análise de grandes regiões genómicas de forma rápida e gera uma grande quantidade de informação, sendo uma ferramenta eficaz na determinação das causas moleculares que levaram à morte, e na identificação de biomarcadores que devem ser investigados nos familiares diretos da vítima de MSC. O objetivo do Laboratório de Virologia e de Análises Clínicas e Forenses (LV-ACF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, INMLCF, foi implementar a aplicação da NGS na análise de amostras biológicas colhidas post-mortem, a cadáveres cuja autópsia médico-legal foi realizada pelo INMLCF e classificada como inconclusiva, com vista a determinar a etiologia molecular de cardiomiopatias e arritmias, utilizando a Sequenciação de Nova Geração para identificar variantes genéticas associadas a estas condições cardíacas. Após a validação dos métodos e dos equipamentos, as autópsias moleculares a partir de amostras colhidas post-mortem pelo INMLCF passaram a ser realizadas pelo LV-ACF, através da utilização de um painel de 62 genes associados a arritmias, e 82 genes associados a cardiomiopatias, num total de 125 genes. Assim, o LV-ACF dotou o INMLCF de capacidade e autonomia no âmbito das autópsias moleculares cardiacas, reduziu custos, possibilitou um maior aproveitamento de recursos, e encetou o caminho para a realização de outros tipos de análises no âmbito da Genética médico-legal, a serem realizadas pelo LV-ACF num futuro próximo.
- Sudden Cardiac Death: The Role of Molecular Autopsy with Next-Generation SequencingPublication . Santos, Agostinho; Amorim, António; Cainé, Laura; Fadoni, JenniferMolecular autopsy is a term employed to describe the investigation of the cause of death through the analysis of genetic information using biological samples collected post-mortem. Its utility becomes evident in situations where conventional medico-legal autopsy methods are not able to identify the cause of death, i.e., in sudden cardiac death (SCD) cases in young individuals, where deaths are commonly due to genetic cardiac conditions, such as cardiomyopathies and channelopathies. The recent advancement in high-throughput sequencing techniques, such as next-generation sequencing (NGS), has allowed the investigation of a high number of genomic regions in a more cost-effective and faster approach. Unlike traditional sequencing methods, which can only sequence one DNA fragment at a time, NGS can sequence millions of short polynucleotide fragments simultaneously. This parallel approach reduces both the time and cost required to generate large-scale genomic data, making it a useful tool for applications ranging from basic research to molecular autopsy. In the forensic context, by enabling the examination of multiple genes or entire exomes and genomes, NGS enhances the accuracy and depth of genetic investigations, contributing to a better understanding of complex inherited diseases. However, challenges remain, such as the interpretation of variants of unknown significance (VUS), the need for standardized protocols, and the high demand for specialized bioinformatics expertise. Despite these challenges, NGS continues to offer significant promise for enhancing the precision of molecular autopsies. The goal of this review is to assess the effectiveness of contemporary advancements in molecular autopsy methodologies when applied to cases of SCD in young individuals and to present an overview of the steps involved in the analysis of NGS data and the interpretation of genetic variants.
- A transexualidade e as perícias em Genética Forense - "a case report"Publication . Fadoni, Jennifer; Ferreira Da Silva, Benedita; Amorim, AntónioA identidade de género e as questões relacionadas com a mudança de sexo têm tido uma importância cada vez maior, tornando-se um relevante ponto de debate e de estudo nos últimos anos. A pessoa transgénero teve um sexo atribuído à nascença que difere daquele com o qual se identifica atualmente. Os dados relativos à prevalência da população transgénero ainda são bastante escassos e dependem da própria definição. Todavia, estimativas sugerem que a prevalência da identidade transgénero varia entre 0,3-0,5% na população norte americana. Enquanto o género pode ser alterado, por exemplo recorrendo procedimentos cirúrgicos e tratamentos hormonais, a informação genética associada à pessoa transgénero não se altera ao longo da sua vida. Assim, numa perícia que requeira a determinação do perfil genético do indivíduo, se os peritos não tiverem conhecimento prévio da alteração de género, os resultados obtidos poderão suscitar dúvidas e até colocar em causa a perícia e a emissão de resultados. Neste trabalho apresentamos o caso de um indivíduo condenado que foi requisitado ao SGBF-N para obtenção do seu perfil genético para inserção da Base de Dados de Perfis de ADN. Aquando da requisição, o indivíduo em questão era identificado civil e judicialmente como pertencente ao género masculino; todavia, no momento da colheita das amostras biológicas o seu género já havia sido alterado legalmente para feminino, tendo inclusivamente alterado o seu nome e documento de identificação. Aquando da receção das amostras, só foi possível associar à requisição original, porque a entidade requisitante forneceu a informação de que o indivíduo em questão ao longo do processo teve o seu género alterado e confirmou a identidade inicial do condenado. As amostras foram registadas no sistema informático considerando a identidade de género atual, feminino, enquanto o perfil genético obtido pertence a um indivíduo do sexo masculino. Este caso demonstra a importância de se debater as questões deste tipo e como é importante ter toda informação possível, para que a perícia não possa ser posta em causa.
- SARS-COV-2 Variants in the region of Lisbon: Comparation and validation study between RT-PCR and NGS methodologiesPublication . Franco, Magda; Cainé, Laura; Rodrigues, Joana; Mofreita, Vânia; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Fadoni, Jennifer; Corte-Real, Francisco; Amorim, AntónioSARS-CoV-2 is a recent coronavirus that appeared in the end of 2019. The World Health Organization named the infection, caused by this new coronavirus, Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). This disease was considered a pandemic on March 11th 2020 by the same organization. Coronaviruses rapidly acquire new mutations and, consequently, new variants keep emerging. There are some variants with an associated risk in the increase of the transmissibility and that cause more severe disease and reduction in the neutralization by antibodies and, for this reason, are called variants of concern. The aim of this project was to identify the main VOCs and VOIs circulating in the region of Lisbon, applying the methodology of real time RT-PCR in cadavers that tested positive for SARS-CoV-2. To meet this goal, we used three assays: Allplex™ SARS-CoV-2 Variants I, Allplex™ SARS-CoV-2 Variants II and Allplex™ SARS-CoV-2 Variants V. The first one detects defining mutations of the Alpha, Beta and Gamma variants (N501Y, E454K and HV69/70del), the second assay detects mutations present in the Delta, Beta, Gamma and California variants (L452R, K417T, K417N and W152C) and the third one detects defining mutations of the Delta and Lambda variants (L452R, P681R, L452Q and F690S). In addition, we also wanted to understand if these RT-PCR assays were efficient to correctly identify these variants, comparing the results obtained to the reference methods for the determination of variants – Next Genration Sequencing (NGS). Two different NGS methodologies were used to compare the results – NGS-ONT (Oxford Nanopore Technologies) and NGS-Sanger based. We concluded that 30% of the samples belonged to the Alpha variant and 70% belonged to the Delta variant and that, in general, the three RT-PCR assays applied in this study were efficient in correctly identifying these two variants, based on the comparison to the NGS results.