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- Desenvolvimento de um método por GC-MS para a confirmação de opiáceos em bílisPublication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Franco, João Miguel; Margalho, CláudiaDe acordo com o metabolismo hepático, os xenobióticos e respetivos metabolitos sofrem excreção biliar ou uma possível circulação entero-hepática. Assim, a bílis pode constituir um reservatório de substâncias metabolizadas e excretadas pelo fígado, sendo considerada uma matriz alternativa viável na análise de drogas de abuso. No entanto, são escassos os estudos que se encontram publicados na literatura sobre a sua utilização recorrendo às metodologias analíticas de triagem por imunoensaios seguida de confirmação por cromatografia de gases – espectrometria de massas (GC-MS). O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de confirmação de opiáceos em amostras de bílis por GC-MS após triagem por imunoensaios. A preparação das amostras foi realizada de acordo com as metodologias analíticas validadas e usadas na rotina do Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. para a análise de opiáceos em sangue: triagem por imunoensaios, seguida de precipitação proteica, extração dos analitos com colunas Oasis® MCX (3 mL, 60 mg), derivatização por microondas dos extratos secos obtidos (MSTFA/5% TMCS, 90 segundos) e, posterior confirmação dos analitos presentes por GC-MS. Em todos os casos de triagem positiva para opiáceos, foi possível detetar e confirmar por GC-MS os analitos morfina, codeína e 6-acetilmorfina, com limites de deteção de 10 ng/mL. O método desenvolvido demonstrou ser útil para a confirmação de opiáceos em bílis por GC-MS, após triagem positiva pela técnica de imunoensaios enzimáticos, sobretudo quando a disponibilidade da matriz postmortem é determinada pelo caso sob investigação.
- Exposição prolongada a cocaína documentada através da análise por segmento de amostras de cabelo de uma criançaPublication . Barroso, Mário; Margalho, Cláudia; Franco, João Miguel
- Análise toxicológica forense a amostras não biológicas e cabelo: investigando a possível relação com um cadáver mumificadoPublication . Margalho, Cláudia; Barroso, Mário; Franco, JoãoA análise toxicológica forense é uma ferramenta fundamental no auxilio da investigação de casos complexos através da identificação de substâncias tóxicas presentes nas amostras relacionadas com essas investigações. Um cenário peculiar que pode requerer essa abordagem especializada é a investigação de um cadáver mumificado. A mumificação é um processo natural ou artificial que preserva o corpo de um cadáver, por um longo período de tempo, muitas vezes ocorrendo em condições que dificultam a decomposição. Neste contexto, este estudo propõe explorar a aplicação da análise toxicológica forense a amostras não biológicas e cabelo, com o objetivo específico de investigar a possível relação entre essas amostras e um cadáver mumificado. Tal investigação é desafiadora, considerando a natureza das amostras e o seu estado de conservação, bem como a necessidade de aplicar metodologias analíticas sensíveis e adaptadas que conduzam à obtenção de resultados fiáveis. Com a crescente necessidade de utilizar métodos interdisciplinares para esclarecer casos desconhecidos, a aplicação da análise toxicológica forense a amostras não biológicas e cabelo apresenta-se como uma abordagem promissora. Ao ampliar o nosso conhecimento sobre a história e circunstâncias que envolvem o cadáver mumificado, podemos contribuir para uma melhor compreensão sobre o passado dessa pessoa assim como para a causa que levou à sua morte. Os autores apresentam um caso de restos humanos decompostos (não identificados) encontrados numa casa devoluta, situados junto a um conjunto de objetos: cachimbo artesanal, bocal, cigarros e seringas. Houve informações de que a vítima seria toxicodependente mas a causa da sua morte foi desconhecida. As amostras não biológicas e o cabelo foram analisadas por GC-MS após extração e limpeza apropriadas. Foram detetadas as seguintes substâncias: seringa A – cocaína, heroína, fenacetina, paracetamol; seringa B - cocaína, fenacetina, cafeína, nicotina, noscapina; bocal – cocaína; cachimbo artesanal – cocaína; fenacetina e paracetamol; cigarro A – nicotina e cotinina; cigarro B – nicotina, cotinina, fenacetina, cafeína. Estes resultados orientaram as análises de Congresso Nacional cabelo para a pesquisa de opiáceos e cocaína. O cabelo foi positivo para cocaína (57 ng/mg), benzoilecgonina (17 ng/mg), norcocaína (2,20 ng/mg), cocaetileno (não quantificado), 6-acetilmorfina (4,65 ng/mg), morfina (4,52 ng/mg), codeína (0,83 ng/mg) e tramadol (0,87 ng/mg). Os achados no cabelo são compatíveis com os da parafernália, o que é muito sugestivo de que, os objetos pertenciam ao cadáver mumificado.
- Microextraction by packed sorbent clean-up for the determination of selected synthetic cathinones in hair samplesPublication . Simão, A.; Margalho, Cláudia; Dinis, P.; Andraus, M.; Barroso, Mário; Gallardo, E.Background and aims: The use of synthetic cathinones (SC), also known as "bath salts," has been increasing in recent years, leading to a growing concern about their effects on public health. Different clean-up approaches have already been studied by different authors. However, microextraction by packed sorbent (MEPS), a miniaturized form of solid-phase extraction, has not been explored extensively for the determination of SC in hair samples. Therefore, we propose the optimization of the MEPS procedure as sample clean-up method followed by gas chromatography mass spectrometry for the determination of these analytes in hair samples. Methods: Hair samples were washed consecutively with dichloromethane, deionized water and methanol to remove dirt and externally deposited material. After drying, hair was scissor-cut into small fragments. Fifty milligrams of hair were incubated overnight in the presence of 1 M NaOH at 45 °C, after which the extracts were neutralized and subjected to MEPS using a C8-SCX cartridge. The compounds were analyzed underivatized by GC-MS in the SIM mode. MEPS conditions were conditioning (250 μL of methanol followed by 250 μL of water), sample loading (24 x 700 μL of hair extract) and elution (7 x 100 μL of 2% NH4OH in acetonitrile). Results and discussion: The procedure resulted in acceptable recoveries (15-59% for all analytes), and allowed reaching lower limits of quantification (LLOQs) of 100 pg/mg for 4-MDMB, 4-MNEB and 4- MDMP and of 200 pg/mg for the remaining analytes (4-CEC, 4-MNEP, 4-MDEB, 4-MDMH, ethylone, alpha-PVP, penthylone, 4-Cl-PVP, MPHP and MDPV). Conclusions: In this work the optimization of the MEPS technique coupled to GC-MS for the determination of selected synthetic cathinones in hair samples is presented. The method was considered suitable for the analysis of these compounds in hair, providing acceptable recoveries and obtaining low limits of quantification.
- Casos positivos de cocaína no Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro: análise comparativa entre 2018 e 2023Publication . Margalho, Cláudia; Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Frias, Eugenia; Franco, João MiguelO Relatório Europeu sobre Drogas 2024, publicado pelo Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência (EMCDDA), oferece uma visão abrangente sobre o estado atual do consumo de drogas na Europa, incluindo a cocaína. Esta substância é a segunda droga ilícita mais consumida na Europa, com sinais crescentes de que a sua elevada disponibilidade continua a ter um impacto negativo na saúde pública europeia. Assim, a análise da evolução dos casos positivos de cocaína é essencial para compreender as tendências do consumo dessa substância e as suas implicações na saúde pública. O Serviço de Química Toxicologia Forenses (SQTF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF, I.P.) desempenha um papel crucial na realização de estudos toxicológicos de drogas de abuso, sendo uma importante fonte de dados para análises ao longo do tempo. Este estudo teve como objetivo realizar uma análise evolutiva dos casos positivos de cocaína na Delegação do Centro (SQTFC) ao longo dos últimos seis anos. Foi efetuada uma compilação dos casos positivos de cocaína do SQTF-C entre 2018 e 2023, tendo em consideração a entidade requisitante, o género e a idade dos indivíduos. Observou-se um crescimento linear ao longo destes seis anos, impulsionado principalmente pelos casos relacionados com a Autoridade Nacional de Segurança Rodoviária (ANSR). No entanto, entre 2020 e 2022, houve um ligeiro decréscimo no número de casos positivos, provavelmente influenciado pela pandemia de COVID-19 e pelas medidas de confinamento. Na análise por género, constatou-se uma clara tendência de maior consumo de cocaína entre homens, com uma prevalência a variar entre 81% e 94%. Em relação à distribuição por faixa etária, 85% dos casos ocorreram em indivíduos entre 18 e 50 anos (299 casos), com uma incidência de 53% no intervalo dos 18 aos 35 anos. Este estudo fornece dados toxicológicos importantes sobre os padrões de consumo de cocaína na região Centro do país nos últimos seis anos, tendo em conta as limitações impostas pelo confinamento. As informações fornecidas pelos dados toxicológicos forenses são fundamentais para contribuir para uma melhor compreensão sobre os padrões de consumo de drogas, identificando quais as substâncias que estão a ser consumidas e em que combinações.
- Determinação de drogas de abuso em fluido oral por precipitação proteica e GC-MS-EIPublication . Santos, Adriana; Monsanto, Paula; Franco, João Miguel; Eusébio, Ermelinda; Margalho, CláudiaO consumo de drogas de abuso pertencentes aos grupos das anfetaminas e metanfetaminas, opiáceos e cocaína e derivados, constitui uma ameaça à saúde pública e estabilidade social. Segundo o Relatório Europeu sobre Drogas de 2022, o consumo de drogas atingiu números elevados em toda a União Europeia. O objetivo deste estudo foi a deteção e confirmação de anfetamina, metanfetamina, benzoilecgonina e morfina em amostras de fluído oral e verificar se houve alguma degradação destas substâncias durante o período de armazenamento das amostras estudadas. Para o efeito foram usadas 53 amostras, previamente fortificadas com concentrações conhecidas das substâncias em estudo (pertencentes aos kits da OraSure Technologies, Inc. e destinados à análise de triagem de drogas de abuso pela técnica imunoenzimática ELISA do sistema Evolis Twin Plus, Bio Rad). As amostras apresentavam prazos de validade situados entre os anos 2021 e 2024. Foram usados volumes de 200 μL de fluido oral, para a extração das substâncias estudadas, usando o procedimento de precipitação proteica com acetonitrilo gelado. Seguidamente os extratos foram analisados por cromatografia de gases associada à espectrometria de massas. A identificação das substâncias foi realizada com um cromatógrafo de gases 7890B equipado com uma coluna cromatográfica HP-5MS (5% de fenilmetilpolisiloxano, 30m x 0,32mm; 0,25μm d.i.) e acoplado a um espetrómetro de massa de quadrupolo simples com uma fonte de impacto eletrónico de alta eficiência 5977A (GC-MS-EI, Agilent Technologies). Os dados foram inicialmente adquiridos em full SCAN e posteriormente em modo selected ion monitoring (SIM) usando o software de aquisição MassHunter WorkStation. As substâncias foram quimicamente derivatizadas por aquecimento induzido por microondas durante 90s (soluções de MBTFA para a anfetamina e metanfetamina e de MSTFA com 5% de TMCS para a morfina e benzoilecgonina) e estudados os seus padrões de fragmentação. Os iões foram escolhidos com base na melhor seletividade e abundância, de modo a maximizar as relações sinal-ruído. O método apresenta um limite de deteção de 20 ng/mL para todas as substâncias,tendo sido possível confirmar a presença de anfetamina, metanfetamina,benzoilecgonina e morfina, de acordo com os critérios de aceitação da World Anti-Doping Agency (WADA). Não se verificaram alterações significativas associadas ao tempo de armazenamento das amostras de fluido oral.
- Viabilidade da amostra de bílis como matriz alternativa na análise de drogas de abuso clássicas por imunoensaiosPublication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Frias, Eugénia; Mustra, Carla; Margalho, Cláudia; Fonte Santa Silva, José Jerónimo; Franco, João MiguelA bílis é um produto de excreção hepática, sendo considerada uma matriz alternativa que pode ser colhida na ausência ou insuficiência de matrizes convencionais ou para complementaridade da análise das mesmas, em situação post-mortem. Esta matriz apresenta uma ampla janela de deteção, comparativamente com o sangue, e elevadas concentrações de drogas e medicamentos e respetivos metabolitos, uma vez que constitui uma via de eliminação de xenobióticos. Na fase de triagem, recorre-se aos imunoensaios enzimáticos, que correspondem a métodos bioanalíticos baseados na interação antigénio-anticorpo, despoletando resultados semi-quantitativos concernentes com a presença ou ausência do analito na amostra. Objetivos: Estudo da viabilidade da bílis, como amostra alternativa, para análise de drogas de abuso clássicas através da técnica de imunoensaios enzimáticos. Materiais e Métodos: A análise das amostras de bílis foi efetuada num equipamento semi-automático, EVOLIS Twin Plus System, seguindo os mesmos procedimentos usados no Serviço de Química e Toxicologia Forenses para as amostras de sangue. Foram usados os testes para análise de opiáceos, metabolitos da cocaína, canabinóides, anfetaminas e de metanfetaminas da OraSure Technologies, Inc. Trata-se de um ensaio competitivo do tipo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) em que, no final é feita a leitura da absorvância de cada amostra, dos controlos e calibradores, sendo o seu valor inversamente proporcional à concentração do analito na amostra. Foram usados os mesmos calibradores cutoff em vigor no SQTF para as amostras de sangue. As amostras de bílis usadas (200μL) foram diluídas em diluente forense, respeitando uma proporção de 1:4. Foram analisados no total 37 casos e posteriormente confirmadas por cromatografia de gases associada à espetrometria de massa (GC-MS) e cromatografia líquida associada à espetrometria de massa (LC-MS-MS). Resultados e Conclusão: Na triagem das amostras de bílis por imunoensaios obtiveram-se resultados positivos e negativos para os diferentes grupos de drogas de abuso, sendo por isso viável a sua utilização através dos procedimentos e protocolos do sangue. Os resultados negativos obtidos e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS permitem-nos excluir a existência de casos de falsos negativos. Alguns dos resultados positivos foram, contudo, confirmados como negativos, evidenciando a existência de interferentes com reatividade cruzada nos diferentes ensaios. Em suma, podemos concluir que a amostra de bílis pode ser usada na triagem de drogas de abuso clássicas por imunoensaios enzimáticos. Sendo uma boa alternativa pois os resultados negativos num ou mais grupos levam a que apenas os positivos sejam confirmados por técnicas mais específicas e demoradas, contribuindo assim para uma resposta mais rápida e menos dispendiosa.
- Toxicologia Forense: métodos analíticos para a determinação de Α-PHP e Α-PIHPPublication . Dinis, Pedro; Franco, João; Margalho, CláudiaA análise mais recente do Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência (EMCDDA), o Relatório Europeu sobre Drogas de 2024, revela um mercado resiliente e influenciado pelos desenvolvimentos globais. Os problemas persistentes de saúde e segurança colocados tanto por drogas ilícitas tradicionais quanto por substâncias mais recentes criam um ambiente desafiador para a elaboração e implementação de respostas eficazes. O termo de Novas Substâncias Psicoativas (NSPs) abrange substâncias não controladas por convenções internacionais, sendo o seu mercado caracterizado pelo constante surgimento de um grande número de substâncias. Entre destas, incluem-se o α- pyrrolidinohexanophenone (α-PHP) e o seu isómero posicional α- pyrrolidinoisohexanophenone (α-PiHP), duas catinonas sintéticas pertencentes ao subgrupo dos derivados da pirovalerona que, em Portugal, apresentam níveis de consumo mais expressivos nos arquipélagos da Madeira e dos Açores. O principal objetivo deste trabalho é compilar os mais recentes dados, internacionalmente publicados, relativos aos métodos analíticos para a determinação das duas catinonas sintéticas, α-PHP e α-PiHP, em amostras biológicas com interesse forense. Foi realizada uma pesquisa bibliográfica nas bases de dados PubMed e b-on entre os anos de 1967 e 2024 com as seguintes palavras-chave: α-PHP, α-PiHP, catinonas sintéticas, NPS e toxicologia forense. Seguidamente, foi feita uma compilação das metodologias analíticas publicadas para a determinação de α-PHP e α-PiHP em amostras biológicas. Nos artigos encontrados e analisados, o α-PHP e o α-PiHP foram detetados tanto em amostras biológicas convencionais (sangue periférico e cardíaco, soro e urina) como em amostras biológicas não convencionais (humor vítreo, bílis, conteúdo gástrico e tecidos sólidos). Na etapa de preparação das matrizes biológicas, as técnicas mais descritas foram a extração líquido-líquido e a extração em fase sólida. Relativamente à análise instrumental, o método mais utilizado foi a cromatografia líquida associada à espetrometria de massa em tandem (LC-MSMS), embora a cromatografia de gases associada à espetrometria de massa (GC /MS) também tenha sido aplicada em estudos recentes. Considerando o impacto que o consumo destas substâncias tem na saúde pública e segurança internacional, é necessário e fundamental continuar a investir no desenvolvimento de metodologias analíticas sensíveis e abrangentes para a deteção de NSPs em diversas matrizes biológicas.
- Α-Pyrrolidinoisohexanophenone (Α-PIHP) in three fatalPublication . Dinis, Pedro; Machado, Francisca; Franco, João; Margalho, CláudiaBackground & Aims The New Psychoactive Substances (NPSs) are widely spread worldwide through the illicit markets and are increasingly the cause of intoxication deaths. Alpha-pyrrolidinoisohexanophenone (α-PiHP) is a positional isomer of α-pyrrolidinohexanophenone (α-PHP) and has been reported for the first time in 2016 at seized materials in China. Both substances are pyrovalerone derivatives from the synthetic cathinones group, and mainly exert cardiovascular, psychological, and neurologic effects. In addition, as published in literature and regardless of their isomerism, both cathinones can appear separately or together in a mixture. This work presents three forensic fatal cases associated with the consumption of α-PiHP and/or α-PHP: case 1 involves a 41-year-old man, drug user, mostly of “bloom”, who committed suicide by hanging; case 2 reports to a 32-year-old man, addicted to synthetic drugs, associated with a sample of “weed” collected next to the corpse; case 3 concerns to a 58-year-old male drug addict, who died after being admitted to the emergency department in a state of coma. Methods The toxicological analyses were carried out in peripheral blood in the three cases and, in case 2, the sample of “weed” was also analysed. Samples (500µL) were prepared with 0.1 M phosphate buffer, extracted by solid-phase extraction and analysed through gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) in full-Scan monitoring mode to search for unknown substances. Subsequently, the samples were analysed in single-ion monitoring mode to confirm the substances detected in full-Scan. The ions 140, 98 and 77 were monitored for α-PiHP; 140, 105 and 77 for α-PHP; and 185 for cocaine-d3 (internal standard). Results & Discussion In case 1 was detected and confirmed α-PiHP. Other substances were also detected and confirmed such as tramadol, fluoxetine, diazepam, nordiazepam, cyamemazine, olanzapine, paliperidone and risperidone. Regarding case 2, in the “weed” we were able to detect several cannabinoids (cannabicyclol, cannabichromene, cannabidiol, cannabidivarol, cannabigerol, cannabinol, delta-9-tetrahydrocannabinol, delta-8-tetrahydrocannabinol and tetrahydrocannabivarin), nicotine and α-PiHP. In peripheral blood was confirmed α-PiHP, cocaine and its metabolites (benzoylecgonine and ecgonine methyl ester), delta-9-tetrahydrocannabinol and 11-nor-9-carboxy-delta-9-tetrahydrocannabinol, phenacetine (a cocaine cutting agent), morphine, paracetamol, alprazolam, nordiazepam, sertraline and mirtazapine. In case 3, both α-PHP and α-PiHP were detected and confirmed in peripheral blood, such as paracetamol. Therefore, the toxicological results of the three cases are relevant to complement the case histories since the presence of α-PiHP in the peripheral blood can be related with the death of individuals. Conclusion With the three cases presented in this work, we can conclude that the search for NPS in biological and non-biological specimens plays an important role, especially in cases of drug-related deaths. The concomitant use of traditional drugs of abuse, prescription medication, α-PHP and α-PiHP, either separately or in combination, increases the possibility of a fatal intoxication since both substances have a high toxic potential.
- Casos fatais associados ao consumo da catinona sintética α-PHPPublication . Franco, João; Margalho, CláudiaIntrodução: As Novas Substâncias Psicoativas (NSP) são alvo de grande preocupação a nível global, apesar dos contínuos esforços empregues pelos sistemas de controlo nacionais e internacionais para limitar a sua disseminação. A alfa-pirrolidinohexanofenona (α-PHP) é uma NSP recente, pertencente ao grupo das catinonas, com um reduzido número de estudos pulicados. Embora exista uma baixa incidência de consumo de NSP em Portugal, houve um notório aumento recente de doses apreendidas de α-PHP e um consequente aumento de casos detetados da substância em matrizes biológicas durante a realização das análises toxicológicas forenses de rotina de drogas de abuso realizadas no Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. Justificou-se, assim, desenvolver e validar uma metodologia analítica para a determinação e quantificação de α-PHP em sangue. Métodos: O procedimento analítico foi devidamente validado segundo a norma publicada pela American Academy of Forensic Sciences (AAFS) Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology (ANSI/ASB Standard 036, 2019). Foram usados volumes de 500 μL de amostra de sangue às quais se adicionou o padrão interno, cocaína-d3. Seguidamente foi empregue a extração em fase sólida (SPE) com colunas de troca catiónica de modo misto (Oasis MCX®). Após secagem, os extratos foram reconstituídos em 60 µL de metanol e posteriormente analisados por GC-MS-EI com monitorização dos iões (77, 105 e 140) previamente selecionados em modo full-scan. Resultados: O método apresentou linearidade entre 10 e 1000 ng/mL, com coeficientes de determinação (r2) superiores a 0.999, exatidão de cada calibrador dentro do intervalo de aceitação de ± 20% e uma distribuição aleatória dos valores dos residuais em torno da linha zero. Foi alcançado um limite de deteção de 5 ng/mL e um limite de quantificação de 10 ng/mL, tendo a eficiência da extração variado entre 98.5% e 103.3%. Foram cumpridos os critérios de aceitação para a precisão intra-dia e intermédia (< 20%) e para o bias (± 20): CV < 17.7% e bias < 11.6%. O α-PHP apresentou estabilidade no sangue por um período de 6h, quando as amostras foram mantidas na bancada à temperatura do laboratório; até 48h, quando os extratos resultantes das amostras processadas foram mantidos no amostrador automático à temperatura da sala dos equipamentos de GC-MS; e por 21 dias após 5 ciclos de congelamento/descongelamento. Não foi observado o fenómeno de carryover. Discussão: A metodologia validada demonstrou ser suficientemente sensível para a determinação de α-PHP em amostras de sangue. Conclusão: A técnica analítica GC-MS-EI revelou-se suficientemente sensível para a determinação do analito estudado em sangue, apresentando uma grande utilidade para ser usada em qualquer laboratório de toxicologia forense, com ou sem tecnologia mais sofisticada. Este é o primeiro procedimento analítico que combina SPE e GC-MS-EI para a determinação de α-PHP em sangue.
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