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- Desenvolvimento de um método por GC-MS para a confirmação de opiáceos em bílisPublication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Franco, João Miguel; Margalho, CláudiaDe acordo com o metabolismo hepático, os xenobióticos e respetivos metabolitos sofrem excreção biliar ou uma possível circulação entero-hepática. Assim, a bílis pode constituir um reservatório de substâncias metabolizadas e excretadas pelo fígado, sendo considerada uma matriz alternativa viável na análise de drogas de abuso. No entanto, são escassos os estudos que se encontram publicados na literatura sobre a sua utilização recorrendo às metodologias analíticas de triagem por imunoensaios seguida de confirmação por cromatografia de gases – espectrometria de massas (GC-MS). O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de confirmação de opiáceos em amostras de bílis por GC-MS após triagem por imunoensaios. A preparação das amostras foi realizada de acordo com as metodologias analíticas validadas e usadas na rotina do Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. para a análise de opiáceos em sangue: triagem por imunoensaios, seguida de precipitação proteica, extração dos analitos com colunas Oasis® MCX (3 mL, 60 mg), derivatização por microondas dos extratos secos obtidos (MSTFA/5% TMCS, 90 segundos) e, posterior confirmação dos analitos presentes por GC-MS. Em todos os casos de triagem positiva para opiáceos, foi possível detetar e confirmar por GC-MS os analitos morfina, codeína e 6-acetilmorfina, com limites de deteção de 10 ng/mL. O método desenvolvido demonstrou ser útil para a confirmação de opiáceos em bílis por GC-MS, após triagem positiva pela técnica de imunoensaios enzimáticos, sobretudo quando a disponibilidade da matriz postmortem é determinada pelo caso sob investigação.
- Exposição prolongada a cocaína documentada através da análise por segmento de amostras de cabelo de uma criançaPublication . Barroso, Mário; Margalho, Cláudia; Franco, João Miguel
- Intoxicação por novas substâncias psicoativas: descrição de um casoPublication . Castro, André Lobo; Sousa, Lara; Quintas, Maria José; Pedro, Costa; Rangel, Rui; Melo, Paula; Carneiro De Sousa Pinto Costa, Maria José; Tarelho, Sónia; Franco, João MiguelIntrodução: As novas substâncias psicoativas (NPS) representam um contexto emergente no mundo desenvolvido, e Portugal não é exceção. Apresentando diversas designações no mercado ilícito, estes compostos surgem de forma regular, substituindo outros previamente identificados pelas autoridades. Desse modo, o “mercado ilícito” tenta circundar as autoridades fiscalizadoras, sendo exemplo a identificação de mais de cem (100) substâncias diferentes, por ano, quer em 2014, quer em 2015. Os dados referentes a intoxicações por estas substâncias são escassos e dispersos devido à referida “volatilidade” no mercado, a qual condiciona o cumprimento dos critérios necessários para a identificação de substâncias. Os autores reportam um caso de intoxicação multi-substâncias, onde se incluem NPS. Material e Métodos: No âmbito da autópsia médico-legal realizada a um indivíduo do sexo masculino, com 26 anos, foram solicitados exames toxicológicos complementares, para determinação de Etanol, Drogas de Abuso e Substâncias Medicamentosas. O procedimento analítico incluiu a extração em fase sólida (SPE) das substâncias de interesse com recurso a cartuchos HLB OASIS® (Waters), e a utilização de técnicas de análise instrumental hifenadas, nomeadamente um cromatógrafo de gases GC-450 acoplado a um espectrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo MS-300 (Bruker), um cromatógrafo de gases GC6780 acoplado a um espectrometro de massa do tipo quadrupolo simples 5973N (Agilent) e um Cromatógrafo líquido de ultra performance (UPLC), acoplado a um espectrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo (WATERS). Foram analisadas amostras de sangue periférico e da cavidade cardíaca e diversos vestígios encontrados junto ao cadáver. Resultados: A análise dos vestígios permitiu a identificação das seguintes substâncias: 3-MeO-PCP (1-[1-(3-metoxifenil)ciclohexil]piperidina), DPT (N,N-dipropiltriptamina), XLR-11 (1-[5-(fluoropentil)-1H-indol-3-il]-(2,2,3,3-tetrametilciclopropil)metanona; 5-MeO-DMT (2-(metoxi-1H-indol-3-il)-N,N-dimetiletanamina) e O-desmetiltramadol (O-DT). A análise do sangue periférico permitiu a determinação de: O-desmetiltramadol (4225 ng/mL), THC (1,20 ng/mL), THCCOOH (4,50 ng/mL), Mianserina (74 ng/mL), Topiramato (VE:6393 ng/mL) e Bromazepam (138 ng/mL). A análise do sangue da cavidade cardíaca permitiu a determinação da 3-MeO-PCP (VE: 525 ng/mL). Todos os outros compostos identificados nos vestígios não foram encontrados nas amostras de sangue analisadas. Discussão: A informação social e os dados da autópsia não permitiram o diagnóstico diferencial médico-legal entre suicídio e acidente. Em contrapartida, a presença de vários compostos leva a concluir que a morte terá sido devida a uma intoxicação multi-substâncias, com especial relevância para os efeitos devidos às NPS presentes no sangue (3-MeO-PCP e O-DT).
- Intoxicação por 1,4-Butanediol: descrição de um casoPublication . Castro, André Lobo; Dias, Ana Sofia; Melo, Paula; Tarelho, Sónia; Franco, João MiguelIntrodução: O Ácido gamahidroxibutírico (GHB) é um composto endógeno, com ação conhecida em diversas áreas cerebrais. O seu uso ilícito inclui objetivos recreativos, o incremento da massa muscular, e como substância facilitadora de abuso sexual. A disponibilidade de dois percursores, nomeadamente a Gamabutirolactona (GBL) e o 1,4-butanediol (1,4-BD), os quais não se encontram alocados à lista de substâncias controladas, contrariamente ao próprio GHB, torna ainda mais fácil a sua obtenção e consumo. Material e Métodos: Um indivíduo do sexo masculino, com 25 anos, deu entrada no Serviço de Urgência de um Hospital Central, em estado de coma (CGS 7), com suspeita de intoxicação por ingestão de líquido, o qual o acompanhava. O SQTF recebeu uma amostra de soro e o referido líquido para análise. O procedimento analítico incluiu a análise direta do líquido por GC-MS, para identificação do mesmo, e a análise da amostra de soro através de extração líquido-líquido das substâncias de interesse, seguida da utilização de técnica de análise instrumental hifenada, nomeadamente um cromatógrafo de gases GC-450 acoplado a um espectrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo MS-300 (Bruker). Resultados e Discussão: A análise do líquido permitiu a identificação da substância 1,4-Butanediol. A análise da amostra de soro permitiu a determinação de GHB numa concentração de 171 mg/L. Paralelamente, foi detetada, pela primeira vez, a presença do metabolito GHB-Glucuronizado (GHB-GLUC), metabolito este recentemente descrito. Conclusão: A informação hospitalar recebida indica que o indivíduo reverteu o estado comatoso, sem sugestão de sequelas neurológicas. Os dados clínicos e os resultados laboratoriais confirmam o diagnóstico de intoxicação por 1,4-Butanediol, detetado pela primeira vez no nosso país.
- Análise toxicológica forense a amostras não biológicas e cabelo: investigando a possível relação com um cadáver mumificadoPublication . Margalho, Cláudia; Barroso, Mário; Franco, JoãoA análise toxicológica forense é uma ferramenta fundamental no auxilio da investigação de casos complexos através da identificação de substâncias tóxicas presentes nas amostras relacionadas com essas investigações. Um cenário peculiar que pode requerer essa abordagem especializada é a investigação de um cadáver mumificado. A mumificação é um processo natural ou artificial que preserva o corpo de um cadáver, por um longo período de tempo, muitas vezes ocorrendo em condições que dificultam a decomposição. Neste contexto, este estudo propõe explorar a aplicação da análise toxicológica forense a amostras não biológicas e cabelo, com o objetivo específico de investigar a possível relação entre essas amostras e um cadáver mumificado. Tal investigação é desafiadora, considerando a natureza das amostras e o seu estado de conservação, bem como a necessidade de aplicar metodologias analíticas sensíveis e adaptadas que conduzam à obtenção de resultados fiáveis. Com a crescente necessidade de utilizar métodos interdisciplinares para esclarecer casos desconhecidos, a aplicação da análise toxicológica forense a amostras não biológicas e cabelo apresenta-se como uma abordagem promissora. Ao ampliar o nosso conhecimento sobre a história e circunstâncias que envolvem o cadáver mumificado, podemos contribuir para uma melhor compreensão sobre o passado dessa pessoa assim como para a causa que levou à sua morte. Os autores apresentam um caso de restos humanos decompostos (não identificados) encontrados numa casa devoluta, situados junto a um conjunto de objetos: cachimbo artesanal, bocal, cigarros e seringas. Houve informações de que a vítima seria toxicodependente mas a causa da sua morte foi desconhecida. As amostras não biológicas e o cabelo foram analisadas por GC-MS após extração e limpeza apropriadas. Foram detetadas as seguintes substâncias: seringa A – cocaína, heroína, fenacetina, paracetamol; seringa B - cocaína, fenacetina, cafeína, nicotina, noscapina; bocal – cocaína; cachimbo artesanal – cocaína; fenacetina e paracetamol; cigarro A – nicotina e cotinina; cigarro B – nicotina, cotinina, fenacetina, cafeína. Estes resultados orientaram as análises de Congresso Nacional cabelo para a pesquisa de opiáceos e cocaína. O cabelo foi positivo para cocaína (57 ng/mg), benzoilecgonina (17 ng/mg), norcocaína (2,20 ng/mg), cocaetileno (não quantificado), 6-acetilmorfina (4,65 ng/mg), morfina (4,52 ng/mg), codeína (0,83 ng/mg) e tramadol (0,87 ng/mg). Os achados no cabelo são compatíveis com os da parafernália, o que é muito sugestivo de que, os objetos pertenciam ao cadáver mumificado.
- Casos positivos de cocaína no Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro: análise comparativa entre 2018 e 2023Publication . Margalho, Cláudia; Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Frias, Eugenia; Franco, João MiguelO Relatório Europeu sobre Drogas 2024, publicado pelo Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência (EMCDDA), oferece uma visão abrangente sobre o estado atual do consumo de drogas na Europa, incluindo a cocaína. Esta substância é a segunda droga ilícita mais consumida na Europa, com sinais crescentes de que a sua elevada disponibilidade continua a ter um impacto negativo na saúde pública europeia. Assim, a análise da evolução dos casos positivos de cocaína é essencial para compreender as tendências do consumo dessa substância e as suas implicações na saúde pública. O Serviço de Química Toxicologia Forenses (SQTF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF, I.P.) desempenha um papel crucial na realização de estudos toxicológicos de drogas de abuso, sendo uma importante fonte de dados para análises ao longo do tempo. Este estudo teve como objetivo realizar uma análise evolutiva dos casos positivos de cocaína na Delegação do Centro (SQTFC) ao longo dos últimos seis anos. Foi efetuada uma compilação dos casos positivos de cocaína do SQTF-C entre 2018 e 2023, tendo em consideração a entidade requisitante, o género e a idade dos indivíduos. Observou-se um crescimento linear ao longo destes seis anos, impulsionado principalmente pelos casos relacionados com a Autoridade Nacional de Segurança Rodoviária (ANSR). No entanto, entre 2020 e 2022, houve um ligeiro decréscimo no número de casos positivos, provavelmente influenciado pela pandemia de COVID-19 e pelas medidas de confinamento. Na análise por género, constatou-se uma clara tendência de maior consumo de cocaína entre homens, com uma prevalência a variar entre 81% e 94%. Em relação à distribuição por faixa etária, 85% dos casos ocorreram em indivíduos entre 18 e 50 anos (299 casos), com uma incidência de 53% no intervalo dos 18 aos 35 anos. Este estudo fornece dados toxicológicos importantes sobre os padrões de consumo de cocaína na região Centro do país nos últimos seis anos, tendo em conta as limitações impostas pelo confinamento. As informações fornecidas pelos dados toxicológicos forenses são fundamentais para contribuir para uma melhor compreensão sobre os padrões de consumo de drogas, identificando quais as substâncias que estão a ser consumidas e em que combinações.
- Intoxicação por MDMA em Candidato a Dador de Coração Parado – Análise de um casoPublication . Castro, André Lobo; Almeida, Dina; Sousa, Lara; Costa, Pedro; Quintas, Maria José; Melo, Paula; Rangel, Rui; Tarelho, Sónia; Franco, João MiguelIntrodução: A dinâmica de consumo de substâncias ilícitas é caracterizada por tendências e “modas”, sempre com o objetivo de obter e experienciar os efeitos desejados, sejam estes de extremação sensorial, entactogénicos ou outros. No entanto, algumas substâncias mantêm‐se no mercado negro de forma consistente ao longo do tempo. É o caso das anfetaminas e dos seus derivados, as quais surgem de forma regular em casos de intoxicação. Os autores apresentam um caso ocorrido no norte de Portugal onde foi detetada MDMA em amostras post‐mortem, bem como em amostras recolhidas ao indivíduo ainda em contexto de emergência hospitalar, salientando‐se a excecionalidade deste procedimento. Material e Métodos: Trata‐se de um homem de 18 anos de idade, sem história conhecida de consumo de drogas de abuso. Foi ativado o INEM por inconsciência / suspeita de intoxicação por substância desconhecida. À chegada da equipa foi constatada respiração ruidosa, midríase fixa e hipertermia (temperatura auricular de 42ºC). Foram realizadas manobras de suporte básico e avançado de vida com administração de adrenalina. A vítima foi transportada ao serviço de urgência hospitalar e na primeira avaliação após constatação de assistolia, foram suspensas as manobras e a vítima foi avaliada e considerada como CDCP (Candidato a Dador de Coração Parado). Foi efetuada autópsia médico‐legal, tendo sido observada congestão visceral global e, a nível pulmonar, sufusões hemorrágicas subpleurais, edema marcado e áreas de hemorragia do parênquima. O exame anátomo‐patológico efetuado ao tecido pulmonar revelou a presença de hemorragia alveolar bilateral. Foram enviadas amostras de sangue periférico e da cavidade cardíaca para o SQTF para processamento analítico para pesquisa de etanol, drogas de abuso e substâncias medicamentosas. Posteriormente foram também recebidas amostras de sangue colhidas no SU com indicação da hora da colheita. Resultados e Discussão: A amostra de sangue periférico foi analisada, tendo sido verificada a ausência de etanol e a presença de lidocaína com uma concentração inferior a 500 ng/mL. O rastreio de drogas de abuso por imunoensaio sugeriu a presença de anfetaminas e derivados. A confirmação/quantificação de anfetaminas por GC‐MS‐single quad (LOD = 10 ng / mL), após o procedimento extrativo por SPE, revelou‐se positiva para MDMA [2278 ng / mL] e para MDA [49 ng / mL]. As amostras colhidas em contexto hospitalar mostraram‐se positivas para MDMA, com valores entre 504 ng/mL e 1918 ng/mL, e MDA, com valores entre 20 ng/mL e 89 ng/mL. Conclusões: Com o presente caso, os autores pretendem ressalvar que a análise dos resultados toxicológicos numa vítima submetida a procedimentos de colheita de órgãos para transplante carece de uma cuidadosa interpretação, tendo em conta o momento em que a colheita de amostra pode ser efetuada durante todo o processo, desde o internamento hospitalar até à realização da autópsia médico‐legal. Salienta‐se ainda a importância da comunicação com as unidades hospitalares, no sentido de, em casos específicos, poderem ser facultadas as amostras colhidas em contexto hospitalar, o mais próximo possível do momento do evento em estudo, tendo em conta que a concentração das substâncias pode alterar‐se durante a manutenção da vítima em suporte de vida.
- Development and validation of a multi-substance method for routine analysis of pesticides in post-mortem samples by UPLC-MS/MSPublication . Matos, Francisco; Barroso, Mário; Antunes, Mónica; Franco, João; Fonseca, SuzanaPesticides play an important role in forensic toxicology and are usually classified as a single class of chemicals, but in fact there are several different types of compounds, including organophosphates, carbamates, pyrethroids or organochlorines, among others, with different toxicities. Pesticide analysis in post-mortem samples can be difficult due to the complexity of the samples and to the high toxicity of these compounds. The aim of this study was to develop and validate an easy to use, sensitive, and robust method, using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry to be incorporated in the routine flow for more than fifty pesticide analysis in post-mortem blood. The developed analytical method was fully validated according to the guiding principles of the ANSI/ASB Standard 036 and applied to routine post-mortem samples, being already detected more than 15 positive cases. This UPLC-MS/MS method is useful and a powerful tool in a toxicology lab because it is fast, simple, effective, and trustworthy. This method is able to detect and analyse pesticides in post-mortem samples. It is set to use for routine analysis and successfully applied to intoxication cases.
- Determinação de drogas de abuso em fluido oral por precipitação proteica e GC-MS-EIPublication . Santos, Adriana; Monsanto, Paula; Franco, João Miguel; Eusébio, Ermelinda; Margalho, CláudiaO consumo de drogas de abuso pertencentes aos grupos das anfetaminas e metanfetaminas, opiáceos e cocaína e derivados, constitui uma ameaça à saúde pública e estabilidade social. Segundo o Relatório Europeu sobre Drogas de 2022, o consumo de drogas atingiu números elevados em toda a União Europeia. O objetivo deste estudo foi a deteção e confirmação de anfetamina, metanfetamina, benzoilecgonina e morfina em amostras de fluído oral e verificar se houve alguma degradação destas substâncias durante o período de armazenamento das amostras estudadas. Para o efeito foram usadas 53 amostras, previamente fortificadas com concentrações conhecidas das substâncias em estudo (pertencentes aos kits da OraSure Technologies, Inc. e destinados à análise de triagem de drogas de abuso pela técnica imunoenzimática ELISA do sistema Evolis Twin Plus, Bio Rad). As amostras apresentavam prazos de validade situados entre os anos 2021 e 2024. Foram usados volumes de 200 μL de fluido oral, para a extração das substâncias estudadas, usando o procedimento de precipitação proteica com acetonitrilo gelado. Seguidamente os extratos foram analisados por cromatografia de gases associada à espectrometria de massas. A identificação das substâncias foi realizada com um cromatógrafo de gases 7890B equipado com uma coluna cromatográfica HP-5MS (5% de fenilmetilpolisiloxano, 30m x 0,32mm; 0,25μm d.i.) e acoplado a um espetrómetro de massa de quadrupolo simples com uma fonte de impacto eletrónico de alta eficiência 5977A (GC-MS-EI, Agilent Technologies). Os dados foram inicialmente adquiridos em full SCAN e posteriormente em modo selected ion monitoring (SIM) usando o software de aquisição MassHunter WorkStation. As substâncias foram quimicamente derivatizadas por aquecimento induzido por microondas durante 90s (soluções de MBTFA para a anfetamina e metanfetamina e de MSTFA com 5% de TMCS para a morfina e benzoilecgonina) e estudados os seus padrões de fragmentação. Os iões foram escolhidos com base na melhor seletividade e abundância, de modo a maximizar as relações sinal-ruído. O método apresenta um limite de deteção de 20 ng/mL para todas as substâncias,tendo sido possível confirmar a presença de anfetamina, metanfetamina,benzoilecgonina e morfina, de acordo com os critérios de aceitação da World Anti-Doping Agency (WADA). Não se verificaram alterações significativas associadas ao tempo de armazenamento das amostras de fluido oral.
- Viabilidade da amostra de bílis como matriz alternativa na análise de drogas de abuso clássicas por imunoensaiosPublication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Frias, Eugénia; Mustra, Carla; Margalho, Cláudia; Fonte Santa Silva, José Jerónimo; Franco, João MiguelA bílis é um produto de excreção hepática, sendo considerada uma matriz alternativa que pode ser colhida na ausência ou insuficiência de matrizes convencionais ou para complementaridade da análise das mesmas, em situação post-mortem. Esta matriz apresenta uma ampla janela de deteção, comparativamente com o sangue, e elevadas concentrações de drogas e medicamentos e respetivos metabolitos, uma vez que constitui uma via de eliminação de xenobióticos. Na fase de triagem, recorre-se aos imunoensaios enzimáticos, que correspondem a métodos bioanalíticos baseados na interação antigénio-anticorpo, despoletando resultados semi-quantitativos concernentes com a presença ou ausência do analito na amostra. Objetivos: Estudo da viabilidade da bílis, como amostra alternativa, para análise de drogas de abuso clássicas através da técnica de imunoensaios enzimáticos. Materiais e Métodos: A análise das amostras de bílis foi efetuada num equipamento semi-automático, EVOLIS Twin Plus System, seguindo os mesmos procedimentos usados no Serviço de Química e Toxicologia Forenses para as amostras de sangue. Foram usados os testes para análise de opiáceos, metabolitos da cocaína, canabinóides, anfetaminas e de metanfetaminas da OraSure Technologies, Inc. Trata-se de um ensaio competitivo do tipo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) em que, no final é feita a leitura da absorvância de cada amostra, dos controlos e calibradores, sendo o seu valor inversamente proporcional à concentração do analito na amostra. Foram usados os mesmos calibradores cutoff em vigor no SQTF para as amostras de sangue. As amostras de bílis usadas (200μL) foram diluídas em diluente forense, respeitando uma proporção de 1:4. Foram analisados no total 37 casos e posteriormente confirmadas por cromatografia de gases associada à espetrometria de massa (GC-MS) e cromatografia líquida associada à espetrometria de massa (LC-MS-MS). Resultados e Conclusão: Na triagem das amostras de bílis por imunoensaios obtiveram-se resultados positivos e negativos para os diferentes grupos de drogas de abuso, sendo por isso viável a sua utilização através dos procedimentos e protocolos do sangue. Os resultados negativos obtidos e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS permitem-nos excluir a existência de casos de falsos negativos. Alguns dos resultados positivos foram, contudo, confirmados como negativos, evidenciando a existência de interferentes com reatividade cruzada nos diferentes ensaios. Em suma, podemos concluir que a amostra de bílis pode ser usada na triagem de drogas de abuso clássicas por imunoensaios enzimáticos. Sendo uma boa alternativa pois os resultados negativos num ou mais grupos levam a que apenas os positivos sejam confirmados por técnicas mais específicas e demoradas, contribuindo assim para uma resposta mais rápida e menos dispendiosa.