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- Sudden Cardiac Death: The Role of Molecular Autopsy with Next-Generation SequencingPublication . Santos, Agostinho; Amorim, António; Cainé, Laura; Fadoni, JenniferMolecular autopsy is a term employed to describe the investigation of the cause of death through the analysis of genetic information using biological samples collected post-mortem. Its utility becomes evident in situations where conventional medico-legal autopsy methods are not able to identify the cause of death, i.e., in sudden cardiac death (SCD) cases in young individuals, where deaths are commonly due to genetic cardiac conditions, such as cardiomyopathies and channelopathies. The recent advancement in high-throughput sequencing techniques, such as next-generation sequencing (NGS), has allowed the investigation of a high number of genomic regions in a more cost-effective and faster approach. Unlike traditional sequencing methods, which can only sequence one DNA fragment at a time, NGS can sequence millions of short polynucleotide fragments simultaneously. This parallel approach reduces both the time and cost required to generate large-scale genomic data, making it a useful tool for applications ranging from basic research to molecular autopsy. In the forensic context, by enabling the examination of multiple genes or entire exomes and genomes, NGS enhances the accuracy and depth of genetic investigations, contributing to a better understanding of complex inherited diseases. However, challenges remain, such as the interpretation of variants of unknown significance (VUS), the need for standardized protocols, and the high demand for specialized bioinformatics expertise. Despite these challenges, NGS continues to offer significant promise for enhancing the precision of molecular autopsies. The goal of this review is to assess the effectiveness of contemporary advancements in molecular autopsy methodologies when applied to cases of SCD in young individuals and to present an overview of the steps involved in the analysis of NGS data and the interpretation of genetic variants.
- Implementação da autópsia molecular utilizando Sequenciação de Nova Geração (NGS) no Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências ForensesPublication . Fadoni, Jennifer; Shastakova, Alena; Cainé, Laura; Santos, Agostinho; Amorim, AntónioA morte súbita cardíaca (MSC) pode ser causada por diversas patologias cardíacas, e na população jovem, geralmente é causada por cardiomiopatias e arritmias, que possuem uma base genética. Nestes casos, o indicado é que sejam realizados testes genéticos post-mortem, também conhecidos como autópsia molecular, cujo objetivo é identificar a causa genética que levou à morte. A sequenciação de nova geração (NGS) permite a análise de grandes regiões genómicas de forma rápida e gera uma grande quantidade de informação, sendo uma ferramenta eficaz na determinação das causas moleculares que levaram à morte, e na identificação de biomarcadores que devem ser investigados nos familiares diretos da vítima de MSC. O objetivo do Laboratório de Virologia e de Análises Clínicas e Forenses (LV-ACF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, INMLCF, foi implementar a aplicação da NGS na análise de amostras biológicas colhidas post-mortem, a cadáveres cuja autópsia médico-legal foi realizada pelo INMLCF e classificada como inconclusiva, com vista a determinar a etiologia molecular de cardiomiopatias e arritmias, utilizando a Sequenciação de Nova Geração para identificar variantes genéticas associadas a estas condições cardíacas. Após a validação dos métodos e dos equipamentos, as autópsias moleculares a partir de amostras colhidas post-mortem pelo INMLCF passaram a ser realizadas pelo LV-ACF, através da utilização de um painel de 62 genes associados a arritmias, e 82 genes associados a cardiomiopatias, num total de 125 genes. Assim, o LV-ACF dotou o INMLCF de capacidade e autonomia no âmbito das autópsias moleculares cardiacas, reduziu custos, possibilitou um maior aproveitamento de recursos, e encetou o caminho para a realização de outros tipos de análises no âmbito da Genética médico-legal, a serem realizadas pelo LV-ACF num futuro próximo.
- Realização de autópsias moleculares em vítimas de morte súbita cardíaca utilizando sequenciação de nova geração (NGS)Publication . Fadoni, Jennifer; Cainé, Laura; Santos, Agostinho; Amorim, AntónioA morte súbita cardíaca (MSC) pode ser causada por diversas patologias cardíacas, e na população jovem, geralmente é causada por cardiomiopatias, das quais a cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é a mais comum. A CMH é considerada a patologia cardiovascular de origem genética mais comum, e em muitos indivíduos, a MSC é a primeira manifestação clínica de CMH. Nestes casos, o indicado é que sejam realizados testes genéticos post-mortem, também conhecidos como autópsia molecular, cujo objetivo é identificar a causa genética que levou à morte. A sequenciação de nova geração (NGS) permite a análise de grandes regiões genómicas de forma rápida e gera uma grande quantidade de informação, sendo uma ferramenta eficaz na determinação das causas moleculares que levaram à morte, e na identificação de biomarcadores que devem ser investigados nos familiares diretos da vítima de MSC. Foram investigados os mecanismos moleculares que causam a CMH, e foram identificados os genes associados à CMH. A seguir, foram selecionados 16 casos de jovens vítimas de MSC com características de CMH, cuja autópsia foi realizada na Delegação do Norte INMLCF, e foi realizada uma autópsia molecular utilizando NGS para investigar as variantes genéticas presentes nas regiões codificantes de 40 genes selecionados. A seguir, foi feita uma expansão do painel de genes elaborado, de forma a abranger genes associados a diversas cardiomiopatias e arritmias. Inicialmente, foi elaborado um painel contendo 40 genes associados à CMH, candidatos, ou associados a CMH-fenocópias. A autópsia molecular realizada nos 16 indivíduos vítimas de MSC selecionados, revelou 37,5% de casos com resultados positivos com variantes patogénicas ou possivelmente patogénicas nos genes MYBPC3 e MYH7. Uma mesma variante genética foi identificada em 31,25% das vítimas de MSC analisadas, sugerindo a presença de uma variante genética fundadora na população Portuguesa. Posteriormente, foram criados dois paineis alargados, para a sequenciação de 62 e 82 genes, que serão utilizados na realização de autópsia molecular em casos de vítimas de MSC devido a arritmias e a cardiomiopatias, respectivamente. O uso de tecnologias NGS para a realização de autópsia molecular em vítimas de MSC fornece informações importantes sobre a etiologia molecular de distúrbios cardíacos. Até ao momento, os estudos genéticos post-mortem foram conclusivos em 37,5% dos casos analisados, com variantes patogénicas ou provavelmente patogénicas presentes nos genes MYBPC3 e MYH7, os principais genes associados à CMH. A mesma variante foi identificada em 31,25% vítimas de MSC analisadas, sugerindo a presença de uma variante genética fundadora na população Portuguesa. Este trabalho, resultou na elaboração de dois paineis de genes e o estudo será alargado a todos os casos de morte súbita em indivíduos com idade inferior a 50 anos e autópsia médico-legal clássica branca, presentes a todos os serviços do INMLCF, desde o ano de 2000 até a data atual.
- Aplicações da sequenciação massiva paralela em análises genéticas de interesse forensePublication . Cainé, Laura; Fadoni, Jennifer; Santos, Agostinho