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- Desenvolvimento de um método por GC-MS para a confirmação de opiáceos em bílisPublication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Franco, João Miguel; Margalho, CláudiaDe acordo com o metabolismo hepático, os xenobióticos e respetivos metabolitos sofrem excreção biliar ou uma possível circulação entero-hepática. Assim, a bílis pode constituir um reservatório de substâncias metabolizadas e excretadas pelo fígado, sendo considerada uma matriz alternativa viável na análise de drogas de abuso. No entanto, são escassos os estudos que se encontram publicados na literatura sobre a sua utilização recorrendo às metodologias analíticas de triagem por imunoensaios seguida de confirmação por cromatografia de gases – espectrometria de massas (GC-MS). O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de confirmação de opiáceos em amostras de bílis por GC-MS após triagem por imunoensaios. A preparação das amostras foi realizada de acordo com as metodologias analíticas validadas e usadas na rotina do Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. para a análise de opiáceos em sangue: triagem por imunoensaios, seguida de precipitação proteica, extração dos analitos com colunas Oasis® MCX (3 mL, 60 mg), derivatização por microondas dos extratos secos obtidos (MSTFA/5% TMCS, 90 segundos) e, posterior confirmação dos analitos presentes por GC-MS. Em todos os casos de triagem positiva para opiáceos, foi possível detetar e confirmar por GC-MS os analitos morfina, codeína e 6-acetilmorfina, com limites de deteção de 10 ng/mL. O método desenvolvido demonstrou ser útil para a confirmação de opiáceos em bílis por GC-MS, após triagem positiva pela técnica de imunoensaios enzimáticos, sobretudo quando a disponibilidade da matriz postmortem é determinada pelo caso sob investigação.
- Casos positivos de cocaína no Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro: análise comparativa entre 2018 e 2023Publication . Margalho, Cláudia; Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Frias, Eugenia; Franco, João MiguelO Relatório Europeu sobre Drogas 2024, publicado pelo Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência (EMCDDA), oferece uma visão abrangente sobre o estado atual do consumo de drogas na Europa, incluindo a cocaína. Esta substância é a segunda droga ilícita mais consumida na Europa, com sinais crescentes de que a sua elevada disponibilidade continua a ter um impacto negativo na saúde pública europeia. Assim, a análise da evolução dos casos positivos de cocaína é essencial para compreender as tendências do consumo dessa substância e as suas implicações na saúde pública. O Serviço de Química Toxicologia Forenses (SQTF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF, I.P.) desempenha um papel crucial na realização de estudos toxicológicos de drogas de abuso, sendo uma importante fonte de dados para análises ao longo do tempo. Este estudo teve como objetivo realizar uma análise evolutiva dos casos positivos de cocaína na Delegação do Centro (SQTFC) ao longo dos últimos seis anos. Foi efetuada uma compilação dos casos positivos de cocaína do SQTF-C entre 2018 e 2023, tendo em consideração a entidade requisitante, o género e a idade dos indivíduos. Observou-se um crescimento linear ao longo destes seis anos, impulsionado principalmente pelos casos relacionados com a Autoridade Nacional de Segurança Rodoviária (ANSR). No entanto, entre 2020 e 2022, houve um ligeiro decréscimo no número de casos positivos, provavelmente influenciado pela pandemia de COVID-19 e pelas medidas de confinamento. Na análise por género, constatou-se uma clara tendência de maior consumo de cocaína entre homens, com uma prevalência a variar entre 81% e 94%. Em relação à distribuição por faixa etária, 85% dos casos ocorreram em indivíduos entre 18 e 50 anos (299 casos), com uma incidência de 53% no intervalo dos 18 aos 35 anos. Este estudo fornece dados toxicológicos importantes sobre os padrões de consumo de cocaína na região Centro do país nos últimos seis anos, tendo em conta as limitações impostas pelo confinamento. As informações fornecidas pelos dados toxicológicos forenses são fundamentais para contribuir para uma melhor compreensão sobre os padrões de consumo de drogas, identificando quais as substâncias que estão a ser consumidas e em que combinações.
- Determinação de drogas de abuso em fluido oral por precipitação proteica e GC-MS-EIPublication . Santos, Adriana; Monsanto, Paula; Franco, João Miguel; Eusébio, Ermelinda; Margalho, CláudiaO consumo de drogas de abuso pertencentes aos grupos das anfetaminas e metanfetaminas, opiáceos e cocaína e derivados, constitui uma ameaça à saúde pública e estabilidade social. Segundo o Relatório Europeu sobre Drogas de 2022, o consumo de drogas atingiu números elevados em toda a União Europeia. O objetivo deste estudo foi a deteção e confirmação de anfetamina, metanfetamina, benzoilecgonina e morfina em amostras de fluído oral e verificar se houve alguma degradação destas substâncias durante o período de armazenamento das amostras estudadas. Para o efeito foram usadas 53 amostras, previamente fortificadas com concentrações conhecidas das substâncias em estudo (pertencentes aos kits da OraSure Technologies, Inc. e destinados à análise de triagem de drogas de abuso pela técnica imunoenzimática ELISA do sistema Evolis Twin Plus, Bio Rad). As amostras apresentavam prazos de validade situados entre os anos 2021 e 2024. Foram usados volumes de 200 μL de fluido oral, para a extração das substâncias estudadas, usando o procedimento de precipitação proteica com acetonitrilo gelado. Seguidamente os extratos foram analisados por cromatografia de gases associada à espectrometria de massas. A identificação das substâncias foi realizada com um cromatógrafo de gases 7890B equipado com uma coluna cromatográfica HP-5MS (5% de fenilmetilpolisiloxano, 30m x 0,32mm; 0,25μm d.i.) e acoplado a um espetrómetro de massa de quadrupolo simples com uma fonte de impacto eletrónico de alta eficiência 5977A (GC-MS-EI, Agilent Technologies). Os dados foram inicialmente adquiridos em full SCAN e posteriormente em modo selected ion monitoring (SIM) usando o software de aquisição MassHunter WorkStation. As substâncias foram quimicamente derivatizadas por aquecimento induzido por microondas durante 90s (soluções de MBTFA para a anfetamina e metanfetamina e de MSTFA com 5% de TMCS para a morfina e benzoilecgonina) e estudados os seus padrões de fragmentação. Os iões foram escolhidos com base na melhor seletividade e abundância, de modo a maximizar as relações sinal-ruído. O método apresenta um limite de deteção de 20 ng/mL para todas as substâncias,tendo sido possível confirmar a presença de anfetamina, metanfetamina,benzoilecgonina e morfina, de acordo com os critérios de aceitação da World Anti-Doping Agency (WADA). Não se verificaram alterações significativas associadas ao tempo de armazenamento das amostras de fluido oral.
- Viabilidade da amostra de bílis como matriz alternativa na análise de drogas de abuso clássicas por imunoensaiosPublication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Frias, Eugénia; Mustra, Carla; Margalho, Cláudia; Fonte Santa Silva, José Jerónimo; Franco, João MiguelA bílis é um produto de excreção hepática, sendo considerada uma matriz alternativa que pode ser colhida na ausência ou insuficiência de matrizes convencionais ou para complementaridade da análise das mesmas, em situação post-mortem. Esta matriz apresenta uma ampla janela de deteção, comparativamente com o sangue, e elevadas concentrações de drogas e medicamentos e respetivos metabolitos, uma vez que constitui uma via de eliminação de xenobióticos. Na fase de triagem, recorre-se aos imunoensaios enzimáticos, que correspondem a métodos bioanalíticos baseados na interação antigénio-anticorpo, despoletando resultados semi-quantitativos concernentes com a presença ou ausência do analito na amostra. Objetivos: Estudo da viabilidade da bílis, como amostra alternativa, para análise de drogas de abuso clássicas através da técnica de imunoensaios enzimáticos. Materiais e Métodos: A análise das amostras de bílis foi efetuada num equipamento semi-automático, EVOLIS Twin Plus System, seguindo os mesmos procedimentos usados no Serviço de Química e Toxicologia Forenses para as amostras de sangue. Foram usados os testes para análise de opiáceos, metabolitos da cocaína, canabinóides, anfetaminas e de metanfetaminas da OraSure Technologies, Inc. Trata-se de um ensaio competitivo do tipo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) em que, no final é feita a leitura da absorvância de cada amostra, dos controlos e calibradores, sendo o seu valor inversamente proporcional à concentração do analito na amostra. Foram usados os mesmos calibradores cutoff em vigor no SQTF para as amostras de sangue. As amostras de bílis usadas (200μL) foram diluídas em diluente forense, respeitando uma proporção de 1:4. Foram analisados no total 37 casos e posteriormente confirmadas por cromatografia de gases associada à espetrometria de massa (GC-MS) e cromatografia líquida associada à espetrometria de massa (LC-MS-MS). Resultados e Conclusão: Na triagem das amostras de bílis por imunoensaios obtiveram-se resultados positivos e negativos para os diferentes grupos de drogas de abuso, sendo por isso viável a sua utilização através dos procedimentos e protocolos do sangue. Os resultados negativos obtidos e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS permitem-nos excluir a existência de casos de falsos negativos. Alguns dos resultados positivos foram, contudo, confirmados como negativos, evidenciando a existência de interferentes com reatividade cruzada nos diferentes ensaios. Em suma, podemos concluir que a amostra de bílis pode ser usada na triagem de drogas de abuso clássicas por imunoensaios enzimáticos. Sendo uma boa alternativa pois os resultados negativos num ou mais grupos levam a que apenas os positivos sejam confirmados por técnicas mais específicas e demoradas, contribuindo assim para uma resposta mais rápida e menos dispendiosa.
- Um químico na Toxicologia...Publication . Monsanto, Paula VenâncioRealidade do serviço de toxicologia forense na área analítica. Retrospetiva de métodos dos anos 80 e 90 com métodos atuais. Papel desempenhado por um químico na realidade da química analítica forense.
- Dental abscess and “unexpected death”...Publication . Costa, Margarida; Henriques de Gouveia, Rosa; Simoes Da Silva, Beatriz; Monsanto, Paula Venâncio; Cordeiro, Cristina; Corte Real, F.Even though we are living in an era of major technical-scientific advances and effective antimicrobial and antiviral therapy,dental infections are still the most important predisposing factors for head and neck infections. Odontogenic infections can cause severe complications, e.g. compromised airways, tissue necrosis, deep neck infections, mediastinitis, endocarditis and sepsis. These severe odontogenic infections can be potentially life-threatening. Usually odontogenic infections respond well to a combination of surgical treatment (incision, rainage) and antibiotic therapy. However, especially when the medico-surgical therapy is installed late, cases may evolve unfavourably and be fatal. The authors report a case of a 30-year-old man who was observed on three consecutive occasions by the General Practitioner in a District Hospital, for a decayed tooth with abscess and was, then, referred to a Central Hospital. There, he was examined for the fourth time, this one by a Stomatologist at the Emergency Department, where he died. The post mortem examination revealed bacterial (Gram +) acute neutrophilic (purulent) infection of soft tissues of the mandibular region and neck with para-tracheal extension, as well as thrombosis ofthe left jugular vein. Circumstantial clinical information, post mortem findings, pathophysiology (including complications andprogression of the disease to death) are discussed, highlighting the relevance of accurate and timely diagnosis and treatmentto avoid malpractice and mortality.
- Bílis como matriz alternativa ou complementar na análise de drogas de abuso e benzodiazepinas por imunoensaios. Estudo preliminar.Publication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Mustra, Carla; Margalho, Cláudia; Frias, Eugénia; Fonte Santa, Jerónimo; Mendes, Luis; Mendonça, Ricardo; Franco, João MiguelA bílis é um fluído corporal que contribui para a purificação do fígado, sendo uma das vias de eliminação de xenobióticos e metabolitos que, uma vez presentes na bílis, são excretados nas fezes. Na ausência ou insuficiência da amostra de sangue, em situação post-mortem, a bílis pode ser colhida através da punção direta na vesícula biliar e consequente aspiração. Esta matriz é considerada uma amostra alternativa valiosa, na medida em que pode apresentar valores elevados das substâncias presentes. Objetivo: Verificar a viabilidade do uso de amostras de bílis nas análises de triagem de drogas de abuso e de benzodiazepinas por imunoensaios enzimáticos. Materiais e Métodos: A análise das amostras de bílis foi efetuada num equipamento semi-automático, EVOLIS Twin Plus System, seguindo os mesmos procedimentos do Serviço de Química e Toxicologia Forenses para as amostras de sangue. Foram usados os testes para análise de opiáceos, metabolitos da cocaína, canabinóides, anfetaminas, metanfetaminas e benzodiazepinas da OraSure Technologies, Inc. As amostras de bílis (200μl) foram diluídas com diluente forense numa proporção de 1:4. Paralelamente, nos casos possíveis, foi também analisada a amostra de sangue. Na avaliação dos resultados qualitativos sobre a presença ou ausência das substâncias a pesquisar foram usados os valores de cut-off em vigor para as amostras de sangue. Posteriormente, realizou-se a confirmação por métodos mais sensíveis e precisos, como a cromatografia de gases associada à espetrometria de massa (GC-MS) e a cromatografia líquida associada à espetrometria de massa (LC-MS-MS). Foram analisados 37 casos, 28 dos quais usámos as amostras de sangue e bílis e 9 só com amostra de bílis, por ausência de sangue. Resultados e Conclusão: Obtiveram-se resultados positivos e negativos nas amostras de bílis para drogas de abuso e benzodiazepinas, viabilizando a utilização da técnica de imunoensaios com os procedimentos do sangue. Os resultados negativos obtidos na bílis nos imunoensaios e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS permitem-nos concluir não haver casos de falsos negativos. Relativamente aos resultados positivos obtidos e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS, obtivemos confirmações positivas e negativas, concluindo-se uma possível existência de interferentes com reatividade cruzada nos imunoensaios. Concluindo, é possível a utilização da amostra de bílis para triagem de drogas de abuso e de benzodiazepinas por imunoensaios; que os resultados negativos poderão ser considerados como válidos por esta técnica e que os resultados positivos nem sempre são confirmados positivos por técnicas mais específicas. A amostra de bílis é, contudo, uma boa alternativa pois o número de resultados negativos é significativo em relação aos positivos e a sua análise por imunoensaios contribui para uma resposta mais rápida e menos onerosa para os nossos clientes, com confirmação apenas dos grupos com resultados positivos.
- Utilização de nitrito de sódio como meio de suicídio. Nova tendência?Publication . Melo, Paula; Vale, Francisco; Rangel, Rui; Castañera, Antonio; Monsanto, Paula; Franco, João MiguelO nitrito de sódio é um composto inorgânico utilizado como preservante na indústria alimentar, na agricultura, como anticorrosivo e como antídoto em caso de intoxicações por cianetos. O consumo deste composto pode ser potencialmente letal, visto este interferir com a capacidade de os glóbulos vermelhos transportarem o oxigénio, fundamental à vida. O ferro da hemoglobina, na presença deste composto, passa à forma férrica, com a formação da sua forma oxidada, a meta-hemoglobina. Esta não possuiu capacidade de ligação ao oxigénio, ocorrendo hipoxia tecidular e morte por asfixia. Tem-se verificado um aumento dos casos de suicídio com este composto em muitos países, uma vez que, para além da sua fácil acessibilidade em lojas físicas e online e do seu baixo preço, este composto é aconselhado em sites pró-suicídio e no livro “The Peaceful Pill Handook”. Informações e kits de suicídio contendo este composto podem ser facilmente obtidos online, sendo frequentemente aconselhada a toma concomitante de medicação para minimizar a sintomatologia, como por exemplo, anti-eméticos. Este composto é geralmente misturado em água e consumido por via oral. O diagnóstico de intoxicação por nitrito de sódio é geralmente feito através dos dados autópticos (presença de sinais gerais de asfixia; livores de coloração acinzentada/acastanhada; sangue e órgãos de coloração acastanhada), dos achados circunstanciais (embalagem do pó; copos contendo soluções com nitrito de sódio, colheres), dos resultados toxicológicos da quantificação de nitritos e/ou nitratos (formados por oxidação dos nitritos) em diversas amostras biológicas, assim como a análise bioquímica da determinação da percentagem de meta-hemoglobina. O objetivo deste trabalho foi o levantamento dos casos de suicídio por nitrito de sódio ocorridos em Portugal, desde o ano de 2020, ano em que surgiu o primeiro caso no nosso país. Através da plataforma StarLims, foram detetados dois casos de suicídio por este composto em 2020, três casos em 2021 e três casos no corrente ano de 2023. Os casos referiam-se a indivíduos do sexo masculino, com idades compreendidas entre os 17 e os 59 anos. Devido à procura aumentada deste composto com vista ao suicídio revelou-se importante a implementação, no SQTF, de uma metodologia de análise de nitritos em amostras biológicas, por espectrofotometria de absorção molecular UV/VIS. É importante que exista um maior controlo dos sites e fóruns pró-suicídio disponíveis na internet de forma a combater a informação facilitadora deste e de outros métodos de suicídio.
- A retrospectÍve analysis of data from cannabinoid forensic cases in the Centre of Portugal between 2020 and 2023Publication . Proença, Paula; Teixeira, Helena M.; Monteiro, Carla; Monsanto, Paula; Coelho, Maria; Franco, João Miguel; Corte Real, FranciscoBackground and aim: Marijuana, hashish and other psychoactive products obtained from Cannabis are the most produced and trafficked illicit drugs around the world. Methods: The authors studied all the positive cases for cannabinoids in the Centre of Portugal; from autopsies at the Forensic Clinical and Pathology Service of Coimbra’s Delegation of the National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences (NILMFS), from other autopsies in the Centre of Portugal, and road traffic and labour accidents from June 2020 until March 2023. Results were from blood samples routinely tested for the presence of cannabinoids by enzyme immunoassay (ELISA) and confirmed by LC-MS/MS. When requested, other substances were analysed. Results and discussion: During the study period, a total of 4599 toxicological requests for cannabinoids were received at the Forensic Toxicology Laboratory. 461 cases (10.0%) tested positive in screening tests, all confirmed by LC-MS/MS. Among positive cases, 77% were road traffic surveillance cases , and 24.9% related to other antemortem and postmortem cases.We observed that there was an accentuated consumption of cannabinoids between ages 21 and 30 years old, average age 33 years, and a higher prevalence in men (92.4%). THC was confirmed and quantified in 76.5% of the cases, with an average blood concentration of 13.5 ng/mL; the mean and percent for the active metabolites, 11-OH-THC, was 5.9 ng/mL in 44.5% and for THCCOOH was 20.1 ng/mL in 56.2% of the positive cases. It is important to highlight that in the 75.1% positive road traffic surveillance cases the achieved THC average was 11.6 ng/mL and in postmortem cases related to road traffic accidents this value increased to 16.0 ng/mL. 25.4% of the cases (n=117) had cannabinoids together with other psychoactive substances and ethanol was present in 162 of the cases, with 33.9% presenting a BAC ≥0.5 <1.2 g/L and 50.6% a BAC ≥1.2 g/L. 20.9% of the Forensic Pathology and Clinic cases were road accidents with 79.2% drivers. Conclusion: Cannabis is frequently used before and during driving with high concentrations of the active compounds demonstrating impairment increasing theof a crash. It is also important to be aware of the results showing simultaneous use of THC and alcohol increasing accident risk.
- Estudo de estabilidade de controlo analítico em método multi-substâncias por LC/MS-MS do SQTF.Publication . Mustra, Carla; Fonseca, Suzana; Monsanto, Paula; Franco, João MiguelINTRODUÇÃO/OBJETIVOS O desenvolvimento e validação de métodos analíticos é uma tarefa fundamental e frequente do Serviço de Química e Toxicologia Forenses (SQTF) que envolve o estudo de vários parâmetros como modelo de calibração, seletividade, sensibilidade, exatidão, precisão, estabilidade, entre outros. O grau de complexidade de uma validação aumenta a par com o número de substâncias abrangidas pelo método, bem como com a especificidade de cada substância. Tão ou mais importante que a validação do método é o seu controlo analítico ao longo do tempo, o que designamos por controlo de qualidade interno, o qual permite avaliar o desempenho do método e do equipamento. O SQTF tem vindo a ampliar o leque de substâncias pesquisadas nos seus laboratórios e a melhorar os níveis de sensibilidade dos métodos, com vista a dar resposta às solicitações. Este crescimento e melhoria dos métodos só foi possível devido à aquisição de novos equipamentos, o que implicou desafios acrescidos relativamente a vários aspetos, em particular quanto à metodologia usada para assegurar um controlo de qualidade interno eficaz. O objetivo deste trabalho é demonstrar como um estudo preliminar da estabilidade de um controlo analítico pode contribuir para a adoção de critérios que permitam avaliar o desempenho do método/equipamento ou mesmo conduzir a novas propostas, como por exemplo a escolha de padrões internos. MATERIAL E MÉTODOS Durante 2 meses foi injetado juntamente com as sequências analíticas de confirmação/quantificação de substâncias medicamentosas de amostras de rotina, um controlo analítico preparado a partir de uma amostra branca (sangue onde previamente se confirmou a ausência das substâncias em estudo) fortificada com cerca de 180 substâncias a uma concentração de 50 ng/mL. Foram avaliadas 177 substâncias medicamentosas relativamente à sua resposta ao longo do tempo (razão entre a área do analito e área de padrão interno: clomipramina d3) num total de 13 injeções. O tratamento estatístico dos dados foi efetuado com recurso à aplicação Microsoft Office Excel®. RESULTADOS E DISCUSSÃO Verificou-se que a maioria das substâncias, cerca de 80%, apresentaram um comportamento estável ao longo do período estudado. Identificaram-se, no entanto, algumas substâncias com variações assinaláveis ao longo do tempo, nomeadamente algumas estatinas e benzodiazepinas cujo coeficiente de variação da razão das áreas é superior a 60%. Nestes casos será importante avaliar as causas destas variações cuja correção poderá, eventualmente, ser implementada através da seleção de um padrão interno mais específico. CONCLUSÕES O estudo de estabilidade de um controlo analítico revelou-se uma ferramenta importante para definir critérios de monitorização do desempenho do método e do próprio equipamento. A maioria das substâncias parece ter estabilidade nas condições testadas, no entanto identificaram-se alguns analitos menos estáveis para os quais será adequado selecionar marcadores de estabilidade ou redefinir padrões internos que sejam mais específicos.