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- ADN antigo: pequenos passos, mas grandes avançosPublication . Correia Dias, Helena; Franco, Magda; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Figueiredo, Alexandra; Monteiro, Cláudio; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO estudo do DNA antigo (aDNA) será sempre uma fonte crucial de informação para a história das populações do passado e do futuro. Ao longo dos anos, o estudo do aDNA tem trazido vários obstáculos aos investigadores, os quais têm tentado novas abordagens para conseguir capturar material genético suficiente para as subsequentes análises. Com os diversos avanços tecnológicos, como a sequenciação genética next generation sequencing (NGS) ou massively parallel sequencing (MPS), novas oportunidades têm surgido. Não obstante, o processamento deste tipo de amostra será sempre desafiador devido às condições inerentes do aDNA, mas também certas condicionantes externas como a possível contaminação por ADN moderno ou contaminação laboratorial cruzada, armazenamento (nem sempre feito da forma mais adequada), ou certas condições ambientais, nas quais o material se encontrava antes de ser recuperado. O Laboratório de ADN Antigo do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses tem estudado remanescentes humanos no âmbito de um projeto colaborativo que abrange a investigação de comunidades de pré-história recente, na região centro de Portugal (MEDICE II). O objectivo desta apresentação consiste na explicação sumária do fluxo laboratorial envolvido no processamento de aDNA, e na apresentação de alguns dos resultados obtidos. No Laboratório de ADN Antigo, o processamento das amostras é feito em salas exclusivamente dedicadas para o efeito, e consiste, sumariamente, nos seguintes passos: 1) pré-tratamento da amostra (limpeza mecânica a baixa velocidade, minimizando o risco de degradação de ADN, e fragmentação/obtenção de pó); 2) extração automática de ADN; 3) quantificação de ADN; 4) sequenciação por MPS; 5) análise e interpretação de resultados. Seguindo o fluxo laboratorial descrito, observou-se, para a amostra em estudo, com cerca de 5000 anos, informações relevantes sobre a origem geográfica e o fenótipo do indivíduo. A análise estatística revelou uma percentagem maioritária para o grupo ancestral europeu e, relativamente ao fenótipo, observou-se que seria um indivíduo de olhos azuis, com uma tonalidade de cor de cabelo clara, e com uma coloração de pele intermédia. Não foi possível obter dados estatísticos para a cor do cabelo, nem informação relativa ao sexo. Passos pioneiros têm sido dados no caminho de expandir a investigação em aDNA e trazer novos avanços para a comunidade científica. Tendo em consideração as características particulares do aDNA, e também certos fatores extrínsecos, estes resultados são extremamente promissores. E, é precisamente por esse motivo, que o estudo do aDNA é uma das análises mais desafiadoras, mas também das mais estimulantes para os peritos forenses.
- ADN antigo: perspetivas e desafiosPublication . Correia Dias, Helena; Franco, Magda; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO DNA antigo (aDNA) pode ser uma fonte crucial de informação para estudos sobre a evolução e história das populações, revelando aspetos importantes, como migrações e interações humanas. Desde o primeiro estudo baseado no isolamento de aDNA, em 1984, novos desafios e oportunidades surgiram na área. Ao longo dos anos, com as melhorias técnicas nos métodos de extração de ADN e a emergência de novas metodologias de sequenciação de alto rendimento, como massive parallel sequencing, foram também impulsionadas novas perspetivas neste campo. Os restos humanos antigos, provenientes de escavações arqueológicas e de coleções museológicas, podem ser difíceis de analisar, principalmente devido à contaminação por ADN moderno, à degradação e exiguidade do aDNA, à contaminação laboratorial, ao armazenamento incorreto, às condições ambientais, entre outros. Além disso, apesar de muitos métodos de pré-tratamento terem sido propostos, poucos estudos relatam a preservação da estrutura e integridade do espécime. Os ossos e dentes são, muitas vezes, a única evidência da existência de um indivíduo ou população e devem ser analisados, mas essencialmente preservados. A análise de aDNA consiste, resumidamente, na preparação da amostra (usando, preferencialmente, um método não invasivo), extração de ADN, quantificação de ADN, PCR e sequenciação. O processo de preparação da amostra é determinante devido às características particulares do aDNA, como a baixa quantidade e a extensa degradação. Uma das questões mais importantes é a autenticidade do aDNA, sendo essencial minimizar o risco de contaminação por ADN moderno. Na extração de ADN, considerando amostras museológicas, é necessário selecionar um método não destrutivo, seguido de um método de quantificação preciso, que permita também otimizar a extração e detectar inibidores da PCR. A PCR deve também ter características específicas, comparando com a amplificação tradicional. Uma PCR dividida em dois passos é essencial para ultrapassar os artefactos do aDNA degradado. É aconselhável fazer múltiplas reações de PCR da mesma amostra e depois sequenciar as réplicas por sequenciação de Sanger. Após alinhamento e comparação das múltiplas sequências, a sequência de interesse é obtida. Recentemente, o Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro (SGBF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) criou um Laboratório de ADN Antigo com o objectivo principal de estudar amostras arqueológicas com diferentes intervalos post-mortem. Considerando que a análise de aDNA desempenha um papel crucial nos estudos arqueológicos e paleogenómicos, o objectivo da presente comunicação é divulgar e partilhar na comunidade científica o nosso novo Laboratório de ADN Antigo do INMLCF e mostrar o seu potencial para a expansão da investigação em aDNA, sendo que este laboratório está integrado num projecto científico que estuda comunidades da pré-história recente, na região centro de Portugal (MEDICE II).
- A Blood–bone–tooth model for age prediction in forensic contextsPublication . Correia Dias, Helena; Manco, Licínio; Corte Real, F.; Cunha, EThe development of age prediction models (APMs) focusing on DNA methylation (DNAm) levels has revolutionized the forensic age estimation field. Meanwhile, the predictive ability of multi-tissue models with similar high accuracy needs to be explored. This study aimed to build multi-tissue APMs combining blood, bones and tooth samples, herein named blood–bone–tooth-APM (BBT-APM), using two different methodologies. A total of 185 and 168 bisulfite-converted DNA samples previously addressed by Sanger sequencing and SNaPshot methodologies, respectively, were considered for this study. The relationship between DNAm and age was assessed using simple and multiple linear regression models. Through the Sanger sequencing methodology, we built a BBT-APM with seven CpGs in genes ELOVL2, EDARADD, PDE4C, FHL2 and C1orf132, allowing us to obtain a Mean Absolute Deviation (MAD) between chronological and predicted ages of 6.06 years, explaining 87.8% of the variation in age. Using the SNaPshot assay, we developed a BBT-APM with three CpGs at ELOVL2, KLF14 and C1orf132 genes with a MAD of 6.49 years, explaining 84.7% of the variation in age. Our results showed the usefulness of DNAm age in forensic contexts and brought new insights into the development of multi-tissue APMs applied to blood, bone and teeth
- Caracterização genética dos imigrantes oriundos de Brasil, Cabo Verde, Angola, Moçambique e Guiné Bissau. Impacto da miscigenação na genética forensePublication . Marcelino, Miguel; Afonso Costa, Heloísa; Correia Dias, Helena; Corte-Real, Francisco; Amorim, AntónioPortugal recebeu um grande influxo de imigrantes oriundos de diversos países. Dentro destes destacam-se aqueles vindos de países pertencentes à Comunidade dos Países de Língua Portuguesa (CPLP). Em 2022 contabilizaram-se cerca de 350 000 imigrantes oriundos destes países, aproximadamente 45% do número total de imigrantes a residir em Portugal. A introdução destas populações imigrantes acrescenta variabilidade genética à população portuguesa pela introdução de variantes genéticas características de populações africanas e sulamericanas. Este facto deve ser avaliado para que na valorização das perícias de genética e biologia forenses a população de referência seja a mais representativa da realidade e se possa alcançar o valor de probabilidade mais correto. A valorização quantitativa da prova biológica é feita, calculando a razão da verossimilhança, Likelihood Ratio (LR). O LR é a razão de duas probabilidades condicionais, que indica o número de vezes que é mais provável a ocorrência dos perfis genéticos determinados admitindo a Hipótese 1 como verdadeira - o indivíduo é o contribuidor -, relativamente à ocorrência desses mesmos perfis admitindo a Hipótese 2 como verdadeira - um indivíduo ao acaso da população de referência é o contribuidor. É então necessário o conhecimento prévio das frequências alélicas, genéticas e haplotípicas da população de referência. A escolha da população de referência pode ser particularmente problemática nas perícias que envolvem imigrantes, já que não é óbvio qual a melhor população de referência a ser utilizada, se a do seu país de origem, se a do local onde está atualmente a residir, ou se a população de referência onde se deu a ocorrência (crime, desaparecimento, procriação). As populações de imigrantes a residir em Lisboa foram sendo estudadas desde 2012 no âmbito do projecto de investigação "A população de Lisboa do início do século XXI: caracterização genética dos novos habitantes oriundos do Brasil, Cabo Verde, Angola e Guiné Bissau". Foram determinadas as frequências alélicas de marcadores genéticos autossómicos, particularmente os da European Standard Set (ESS) e do Combined DNA Index System (CODIS). Foram determinadas as frequências alélicas de marcadores genéticos do cromossoma X, as frequências haplotípicas de marcadores genéticos do cromossoma Y e frequências haplotípicas da região controlo do ADN mitocondrial. Relativamente e mais particularmente ao estudo do ADN mitocondrial verificou-se que estes imigrantes apresentam maioritariamente haplótipos pertencentes a haplogrupos tipicamente africanos e sul-americanos. É importante considerar que a miscigenação contínua entre diferentes grupos étnicos gera uma maior diversidade genética sendo necessária a constante atualização das bases de dados referentes às populações de referência para garantir uma representação precisa e fornecer uma valorização da prova biológica consentânea com a realidade populacional.
- Challenges and (Un)Certainties for DNAm Age Estimation in FuturePublication . Correia Dias, Helena; Cunha, E; Corte Real, F.; Manco, LicínioAge estimation is a paramount issue in criminal, anthropological, and forensic research. Because of this, several areas of research have focused on the establishment of new approaches for age prediction, including bimolecular and anthropological methods. In recent years, DNA methylation (DNAm) has arisen as one of the hottest topics in the field. Many studies have developed age- prediction models (APMs) based on evaluation of DNAm levels of many genes in different tissue types and using different methodological approaches. However, several challenges and confounder factors should be considered before using methylation levels for age estimation in forensic contexts. To provide in-depth knowledge about DNAm age estimation (DNAm age) and to understand why it is not yet a current tool in forensic laboratories, this review encompasses the literature for the most relevant scientific works published from 2015 to 2021 to address the challenges and future directions in the field. More than 60 papers were considered focusing essentially on studies that developed models for age prediction in several sample types
- Cronómetros do Esqueleto: a metilação de ADN como o novo método da estimativa da idade para remanescentes humanos esqueletizados.Publication . Silva, João; Correia Dias, Helena; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioNos últimos anos, a análise da metilação do ADN (DNAm) surgiu como uma ferramenta promissora para a estimativa da idade à morte do indivíduo, em contexto médico-legal e forense. Em situações mais complexas que envolvem remanescentes humanos esqueletizados não identificados, a estimativa da idade à morte é um pilar essencial, ajudando na identificação, mas também no redireccionamento da investigação forense e criminal. Este estudo tem como objetivo aplicar em remanescentes mortais esqueletizados de indivíduos da população portuguesa, o modelo de predição de idade (age prediction model, APM), originalmente desenvolvido em ossos frescos de indivíduos portugueses por Correia Dias et al. (2020). Com este trabalho pretendemos impulsionar o desenvolvimento de novas metodologias para a estimativa da idade em material esquelético mais comprometido, em contexto médico-legal e forense. Uma vez que os ossos são frequentemente o único material biológico disponível em situações em que a morte não tenha sido recente, a estimativa de idade baseada nos níveis de DNAm capturados em ossos oferece vantagens distintas sobre as abordagens morfológicas tradicionais quando os restos mortais estão altamente degradados ou incompletos. Este estudo centra-se na análise dos padrões de DNAm dos genes C1orf132, EDARADD e ELOVL2, que têm mostrado, consistentemente, fortes correlações com a idade cronológica em vários tecidos, incluindo ossos. Dados os desafios inerentes ao ADN degradado em amostras de ossos secos, este projeto desenvolveu e otimizou um protocolo que inclui várias extrações de ADN por amostra e uma etapa de concentração subsequente para maximizar o rendimento e a qualidade do ADN. O ADN foi extraído usando o kit PrepFiler Express BTATM, quantificado com o kit QuantifilerTM Trio e concentrado através de dispositivos de filtro centrífugo Microcon®. A conversão de bissulfito foi efetuada com o kit EZ ADN Methylation-GoldTM, permitindo uma avaliação precisa dos níveis de DNAm nos locais CpG alvo. A fase experimental do projeto envolveu a análise de amostras de ossos de casos do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) de 2017 a 2021. Após a extração, quantificação e concentração do ADN, o ADN foi convertido através de bissulfito de sódio e submetido à amplificação por PCR e sequenciação de Sanger para avaliar a DNAm nos CpGs alvo. A correlação entre os níveis de DNAm e a idade cronológica dos indivíduos será analisada estatisticamente com o software IBM SPSS, v.27, usando modelos de regressão linear. O APM tecido-específico previamente desenvolvido em ossos de cadáveres frescos (Correia Dias et al., 2020) será aplicado a ossos de casos forenses do INMLCF. Espera-se que os resultados contribuam para o desenvolvimento de protocolos normalizados estimulando a investigação futura sobre aplicações forenses baseadas na análise da DNAm. Acredita-se que os avanços no domínio da epigenética forense possam apoiar a resolução de casos forenses complexos.
- Drop-outs alélicos: implicações nas perícias médico-legaisPublication . Franco, Magda; Correia Dias, Helena; Coimbra Serra, Armando; São Bento, Marta; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO perfil genético de um indivíduo constitui uma ”impressão digital” genética, sendo obtido através da análise de regiões específicas do ADN que apresentam elevada variabilidade entre indivíduos. No Serviço de Genética e Biologia Forenses do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, o perfil genético é determinado com recurso à análise de marcadores constituídos por sequências curtas e repetitivas de ADN designadas por Short Tandem Repeats (STR). O processamento laboratorial dos casos periciais é realizado por dois peritos distintos, de forma independente, e compreende as etapas de extração de ADN, amplificação por PCR e análise de fragmentos. Para a amplificação são usados dois kits diferentes: o GlobalFiler e o PowerPlex Fusion 6C, que permitem a análise de 24 e 28 marcadores STR, respetivamente. Estes kits partilham vários marcadores e, quando aplicados à mesma amostra, é expectável que os alelos coincidam, permitindo assim confirmar a identidade do indivíduo e aumentar a robustez dos resultados periciais. O presente trabalho tem como objetivo apresentar dois casos em que se observaram discrepâncias nos perfis genéticos obtidos com os dois kits referidos, nomeadamente nos marcadores D12S391 e D18S51, nas mesmas amostras de referência. No caso 1, no marcador D12S391, apenas foi detetado o alelo 17 na amplificação com o kit GlobalFiler, enquanto que com o kit PowerPlex Fusion 6C foram detetados os alelos 17 e 20. No caso 2, no marcador D18S51, ocorreu uma situação similar em que na amplificação com o kit Globalfiler foi detetado apenas o alelo 13, enquanto que com o kit PowerPlex Fusion 6C foram detetados os alelos 12 e 13. Importa referir que ambos os casos se referem a amostras de referência, e que as amplificações foram repetidas com os dois kits com o objetivo de confirmar os perfis genéticos previamente obtidos. As discrepâncias observadas poderão ser justificadas pela ocorrência de mutações nos locais de annealing dos primers do kit GlobalFiler, conduzindo a fenómenos de allelic drop-out e, consequentemente, à não deteção de determinados alelos. Estes casos refletem algumas das dificuldades enfrentadas na rotina laboratorial forense, sendo que são de maior relevância quando se trata de amostras problema tanto de casos criminais, como de casos de identificação individual, podendo ter implicações significativas na interpretação dos resultados. Acresce que, a introdução na base de dados de apenas o perfil obtido com um dos kits (e.g., GlobalFiler) poderia resultar em ocorrência de hits incompletos, comprometendo a eficácia das buscas. Em suma, torna-se fundamental que o perito adote uma abordagem crítica e minuciosa na avaliação de cada caso, promovendo a validação cruzada dos perfis genéticos obtidos com diferentes sistemas multiplex. Idealmente, devem ser analisadas duas amostras biológicas distintas do mesmo indivíduo (e.g., sangue e saliva) com ambos os kits, reforçando a confiança e fiabilidade dos resultados obtidos.
- Estimativa da idade epigenética em ossos: avaliação dos níveis de metilação de DNA no gene FHL2 por droplet digital PCRPublication . Correia Dias, Helena; Manco, LicínioA estimativa da idade epigenética é uma abordagem inovadora em contextos forenses, sendo os ossos uma das amostras mais relevantes no campo legal. Nos últimos anos, o nosso grupo construiu vários modelos de predição de idade (age prediction models, APMs), em diferentes tecidos biológicos, usando diferentes metodologias para a análise dos níveis de metilação de DNA (DNAm), nomeadamente sequenciação de Sanger e SNaPshot. Contudo, a avaliação dos níveis de metilação pode ser influenciada pelo método, com consequências na precisão da estimativa da idade. Recentemente, o nosso grupo desenvolveu diversos APMs específicos para amostras de sangue de indivíduos vivos e mortos, utilizando a técnica de droplet digital PCR (ddPCR). O presente trabalho teve como objetivo avaliar os níveis de DNAm do gene FHL2 em ossos de indivíduos portugueses usando a técnica de ddPCR com vista a desenvolver um APM aplicável a laboratórios forenses. Foram recolhidas 26 amostras de ossos (4 mulheres, 22 homens, com idades entre 26 a 80 anos) durante autópsias médico-legais no Serviço de Patologia Forense da Delegação do Centro e do Sul do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, depois de consultar o Registo Nacional de Não Dadores, durante o período de 2018 a 2020. Após extração, o DNA foi submetido a conversão por bissulfito de sódio, a que se seguiu a análise com um ensaio duplex-ddPCR visando o DNA metilado e o DNA não-metilado do CpG cg06639320 localizado no gene FHL2, durante o ano de 2024. Os ensaios foram realizados no sistema QX100™ Droplet Digital™ PCR (Bio- Rad, CA, USA). A relação entre a idade cronológica e os níveis de DNAm foi avaliada por regressão linear simples recorrendo ao software IBM SPSS, v.27. Foi obtida uma forte correlação entre os níveis de DNAm e a idade (R = 0,849; P = 4,136 x 10-8), explicando 71% da variação na idade (R2 ajustado). O APM construído com os coeficientes estatísticos revelou um valor médio do desvio entre a idade cronológica e prevista, [mean absolute deviation between chronological and predicted ages (MAD)], de 6,09 anos. A precisão do APM foi avaliada através de 3-fold cross validation obtendo-se uma MAD média de 6,44 anos. Comparando estes resultados com os previamente publicados pelo nosso grupo em ossos para o mesmo CpG usando as técnicas de sequenciação de Sanger e SNaPshot observou-se neste estudo um valor superior de correlação DNAm vs. idade e um valor de MAD inferior, evidenciando um aumento na precisão dos APMs construídos por ddPCR. Os resultados obtidos reforçam a utilidade da ddPCR para a estimativa da idade epigenética. O APM desenvolvido revela melhor precisão na estimativa da idade comparativamente à precisão reportada previamente usando a mesma amostra com diferentes métodos, podendo colocar a técnica de ddPCR como uma das mais promissoras para avaliação de níveis de DNAm a ser implementada em laboratórios forenses.
- Metodologias para preparação e extração de ADN de fragmentos humanos antigos: uma revisão preliminarPublication . Franco, Magda; Correia Dias, Helena; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO Laboratório de ADN Antigo do Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) tem como objetivo, entre outros, analisar fragmentos humanos antigos (ossos e dentes). Pretende assim, através de análises genéticas, contribuir para estudos relacionados com a evolução de populações antigas humanas, assim como a sua relação com a população atual. A reduzida quantidade de ADN e o elevado nível de degradação são dois dos desafios mais comuns quando se trabalha com ADN antigo (aDNA). É crucial diferenciar o ADN exógeno do aDNA autêntico, visto que estas amostras estão sujeitas a contaminações ambientais e humanas. Tendo em conta a pouca qualidade esperada das amostras, será mais eficaz o estudo do ADN mitocondrial (mtDNA) do que do ADN nuclear, já que o mtDNA está presente nas células num maior número de cópias e apresenta uma configuração molecular circular fechada, que resulta numa maior proteção. Por outro lado, como este ADN é herdado apenas por via materna, o seu estudo não é muito utilizado nas identificações individuais, mas é uma fonte importante de ADN para realizar estudos populacionais, sendo que nos permite obter informações sobre as linhagens maternas dos indivíduos. De acordo com a literatura, os métodos de pré-processamento usados antes da extração de ADN podem afetar a autenticidade e a quantidade de ADN obtido. Várias técnicas de pré-tratamento são utilizadas atualmente, tais como, limpeza da superfície do osso com lixívia, seguido de limpeza com água e, por fim, com etanol. Também é utilizada luz UV para garantir que o ADN extraído será autêntico e não de fontes exógenas. Em análises forenses, os dentes e ossos são normalmente reduzidos a pó para a extração de ADN. Tem sido também demonstrado que é possível obter bons resultados com um método diferente -"scrapping"-, sendo que esta técnica preserva melhor a amostra. No entanto, é necessário avaliar a idade, o estado e o nível de degradação do osso/dente, sendo que amostras frágeis podem ser quebradas facilmente, mesmo com este método. Na fase de extração, existem vários métodos que podem ser usados: métodos baseados em colunas (rápidos,mas produzem pouca quantidade de ADN); e métodos baseados em sílica, precipitação e microfiltros (demorados e trabalhosos, mas produzem melhores resultados). Também existe o método de fenol-clorofórmio (ainda de referência e utilizado por vários anos), que é trabalhoso e envolve riscos para o operador. Em suma, é importante fazer uma revisão dos métodos mais adequados para o tratamento e extração destas amostras difíceis, tendo em conta a manutenção da integridade das mesmas, para que possam ser utilizadas em investigações futuras ou expostas em museus. Assim, esta revisão serve como um primeiro passo para a implementação das metodologias mais adequadas para a obtenção de aDNA autêntico de restos humanos antigos para estudos futuros no Laboratório de ADN Antigo do INMLCF.