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- Avaliação Direta do Kit Investigator® 26plex QS com outros Kits utilizados na rotina laboratorial do SGBF-CPublication . Cardoso, Paula; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Cunha, Patrícia; Shataskova, Alena; São Bento, Marta; Bento, Ana Margarida; Sampaio, Lisa; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroA identificação individual carece do estudo e caracterização de marcadores polimórficos presentes no ADN, sendo a análise de Short Tandem Repeats (STRs) a metodologia de eleição em Genética Forense. A introdução da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) revolucionou a área forense, dado que permite a obtenção de inúmeras cópias de ADN, através da amplificação de sequências específicas de interesse. O contínuo desenvolvimento científico e o aparecimento de novas metodologias, compele à atualização dos procedimentos laboratoriais implementados, de forma a rentabilizá-los e torná-los mais eficientes. No entanto, a implementação de uma metodologia, num laboratório acreditado, requer uma validação interna que compreende uma análise extensiva a fim de confirmar a sua adequabilidade. A avaliação direta por comparação com métodos desenvolvidos constitui uma fase crucial deste processo. O kit Investigator® 26plex QS, da QIAGEN, assenta numa reação de PCR multiplex, através da amplificação simultânea de 24 STRs, 2 Sensores de Qualidade e Amelogenina. Os Sensores de Qualidade inclusos neste kit de amplificação permitem inferir sobre a qualidade da amostra e o sucesso da reação de PCR, alertando, igualmente, para a presença de inibidores. Com o objetivo de avaliar o kit Investigator® 26plex QS, nomeadamente por comparação direta com as metodologias já implementadas e validadas no SGBF-C, o GlobalFiler™ PCR Amplification Kit e o PowerPlex® Fusion 6C System, foram selecionadas 24 amostras para amplificação (PE-SGBF-C-001 Rev09, Determinação de perfil genético de ADN por PCR/eletroforese capilar a partir de amostras de referência de sangue e saliva – procedimento interno do SGBF-C). A eletroforese capilar realizou-se no sequenciador automático ABI PRISM® 3500 Genetic Analyzer, seguindo-se a análise dos eletroferogramas através do software GeneMapper™ ID-X 1.6. Neste estudo foi possível constatar que os perfis genéticos obtidos com o kit Investigator® 26plex QS são concordantes com os perfis resultantes da análise através das metodologias supramencionadas. Adicionalmente, os dados preliminares deste trabalho evidenciam o potencial deste kit de amplificação e sugerem tratar-se de uma metodologia robusta de análise. Sendo, não obstante, imprescindível a realização de estudos complementares de validação.
- In house Real-Time PCR multiplex for simultaneous detection of human influenza A and B virus and respiratory syncytial virusPublication . Fadoni, Jennifer; Cainé, Laura; Rodrigues, Joana; Mofreita, Vânia; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Corte Real, F.; Amorim, António
- Hepatitis A: Ultrasensitive enzyme-linked fluorescence assay in occasional detection of prior contact in a medico-legal sample In LisbonPublication . Mofreita, Vânia; Cainé, Laura; Rodrigues, Joana; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Fadoni, Jennifer; Corte Real, F.; Amorim, António
- Next Generation Sequencing for variant detection of SARS-CoV-2 in a medico-legal context in the second year of the PandemicPublication . Rodrigues, Joana; Cainé, Laura; Mofreita, Vânia; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Fadoni, Jennifer; Corte Real, F.; Amorim, António
- Transmissão de HIV no âmbito de crimes de agressão sexualPublication . Amorim, António; Mofreita, Vânia; Rodrigues, Joana; Corte Real, F.; Cainé, Laura
- Metodologias para preparação e extração de ADN de fragmentos humanos antigos: uma revisão preliminarPublication . Franco, Magda; Correia Dias, Helena; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO Laboratório de ADN Antigo do Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) tem como objetivo, entre outros, analisar fragmentos humanos antigos (ossos e dentes). Pretende assim, através de análises genéticas, contribuir para estudos relacionados com a evolução de populações antigas humanas, assim como a sua relação com a população atual. A reduzida quantidade de ADN e o elevado nível de degradação são dois dos desafios mais comuns quando se trabalha com ADN antigo (aDNA). É crucial diferenciar o ADN exógeno do aDNA autêntico, visto que estas amostras estão sujeitas a contaminações ambientais e humanas. Tendo em conta a pouca qualidade esperada das amostras, será mais eficaz o estudo do ADN mitocondrial (mtDNA) do que do ADN nuclear, já que o mtDNA está presente nas células num maior número de cópias e apresenta uma configuração molecular circular fechada, que resulta numa maior proteção. Por outro lado, como este ADN é herdado apenas por via materna, o seu estudo não é muito utilizado nas identificações individuais, mas é uma fonte importante de ADN para realizar estudos populacionais, sendo que nos permite obter informações sobre as linhagens maternas dos indivíduos. De acordo com a literatura, os métodos de pré-processamento usados antes da extração de ADN podem afetar a autenticidade e a quantidade de ADN obtido. Várias técnicas de pré-tratamento são utilizadas atualmente, tais como, limpeza da superfície do osso com lixívia, seguido de limpeza com água e, por fim, com etanol. Também é utilizada luz UV para garantir que o ADN extraído será autêntico e não de fontes exógenas. Em análises forenses, os dentes e ossos são normalmente reduzidos a pó para a extração de ADN. Tem sido também demonstrado que é possível obter bons resultados com um método diferente -"scrapping"-, sendo que esta técnica preserva melhor a amostra. No entanto, é necessário avaliar a idade, o estado e o nível de degradação do osso/dente, sendo que amostras frágeis podem ser quebradas facilmente, mesmo com este método. Na fase de extração, existem vários métodos que podem ser usados: métodos baseados em colunas (rápidos,mas produzem pouca quantidade de ADN); e métodos baseados em sílica, precipitação e microfiltros (demorados e trabalhosos, mas produzem melhores resultados). Também existe o método de fenol-clorofórmio (ainda de referência e utilizado por vários anos), que é trabalhoso e envolve riscos para o operador. Em suma, é importante fazer uma revisão dos métodos mais adequados para o tratamento e extração destas amostras difíceis, tendo em conta a manutenção da integridade das mesmas, para que possam ser utilizadas em investigações futuras ou expostas em museus. Assim, esta revisão serve como um primeiro passo para a implementação das metodologias mais adequadas para a obtenção de aDNA autêntico de restos humanos antigos para estudos futuros no Laboratório de ADN Antigo do INMLCF.
- Validação e implementação do painel Precision ID GlobalFilerTM NGS STR v2 em amostras forensesPublication . Catré, Inês; Shastakova, Alena; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Cunha, Patrícia; São Bento, Marta; Bento, Ana Margarida; Sampaio, Lisa; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroO Serviço de Genética e Biologia Forenses do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. da Delegação do Centro (SGBF-C) pretende implementar a metodologia de Next Generation Sequencing (NGS) aplicada a Short Tandem Repeats (STRs) autossómicos. Com esse propósito foi realizado um estudo para validação do painel Precision ID GlobalFilerTM NGS STR panel v2 da Applied Biosystems ThermoFisher Scientific. Esta tecnologia permite realizar a sequenciação de um elevado número de fragmentos de ADN por amostra, levando à determinação de um maior número de alelos por marcador genético, não detetáveis através da metodologia usualmente utilizada para STRs autossómicos no SGBF-C. Antes de realizar a implementação de uma nova metodologia na rotina de um laboratório acreditado é necessário testar e validar o novo método. Neste estudo foram selecionadas várias amostras de processos criminais e de processos de parentesco, previamente analisadas por Eletroforese Capilar (EC), pretendendo-se avaliar o potencial desta nova metodologia, nomeadamente através do aumento do poder de discriminação. Durante todo o procedimento foram seguidas as recomendações da casa comercial para a utilização deste painel, com recurso aos equipamentos HID Ion ChefTM e Ion S5TM System. Após a análise dos resultados com o ConvergeTM Software, e realizando uma comparação com os resultados previamente obtidos para EC, foi possível concluir que o painel de GlobalFiler para NGS traz algumas vantagens em relação ao kit GlobalFiler™ PCR Amplification para EC. No entanto, antes da sua implementação, deverão ser realizados mais alguns estudos complementares de validação.
- ADN antigo: perspetivas e desafiosPublication . Correia Dias, Helena; Franco, Magda; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO DNA antigo (aDNA) pode ser uma fonte crucial de informação para estudos sobre a evolução e história das populações, revelando aspetos importantes, como migrações e interações humanas. Desde o primeiro estudo baseado no isolamento de aDNA, em 1984, novos desafios e oportunidades surgiram na área. Ao longo dos anos, com as melhorias técnicas nos métodos de extração de ADN e a emergência de novas metodologias de sequenciação de alto rendimento, como massive parallel sequencing, foram também impulsionadas novas perspetivas neste campo. Os restos humanos antigos, provenientes de escavações arqueológicas e de coleções museológicas, podem ser difíceis de analisar, principalmente devido à contaminação por ADN moderno, à degradação e exiguidade do aDNA, à contaminação laboratorial, ao armazenamento incorreto, às condições ambientais, entre outros. Além disso, apesar de muitos métodos de pré-tratamento terem sido propostos, poucos estudos relatam a preservação da estrutura e integridade do espécime. Os ossos e dentes são, muitas vezes, a única evidência da existência de um indivíduo ou população e devem ser analisados, mas essencialmente preservados. A análise de aDNA consiste, resumidamente, na preparação da amostra (usando, preferencialmente, um método não invasivo), extração de ADN, quantificação de ADN, PCR e sequenciação. O processo de preparação da amostra é determinante devido às características particulares do aDNA, como a baixa quantidade e a extensa degradação. Uma das questões mais importantes é a autenticidade do aDNA, sendo essencial minimizar o risco de contaminação por ADN moderno. Na extração de ADN, considerando amostras museológicas, é necessário selecionar um método não destrutivo, seguido de um método de quantificação preciso, que permita também otimizar a extração e detectar inibidores da PCR. A PCR deve também ter características específicas, comparando com a amplificação tradicional. Uma PCR dividida em dois passos é essencial para ultrapassar os artefactos do aDNA degradado. É aconselhável fazer múltiplas reações de PCR da mesma amostra e depois sequenciar as réplicas por sequenciação de Sanger. Após alinhamento e comparação das múltiplas sequências, a sequência de interesse é obtida. Recentemente, o Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro (SGBF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) criou um Laboratório de ADN Antigo com o objectivo principal de estudar amostras arqueológicas com diferentes intervalos post-mortem. Considerando que a análise de aDNA desempenha um papel crucial nos estudos arqueológicos e paleogenómicos, o objectivo da presente comunicação é divulgar e partilhar na comunidade científica o nosso novo Laboratório de ADN Antigo do INMLCF e mostrar o seu potencial para a expansão da investigação em aDNA, sendo que este laboratório está integrado num projecto científico que estuda comunidades da pré-história recente, na região centro de Portugal (MEDICE II).
- Aplicação forense de marcadores genéticos de ancestralidade biogeográfica e características visíveis externamente: interpretação e relatório pericialPublication . Afonso Costa, Heloísa; Amorim, António; Nascimento, Rui; Cainé, Laura; Cunha, Eugénia; Corte Real, FranciscoA capacidade de multiplexação da sequenciação massiva em paralelo (MPS), em simultâneo com a capacidade de análise de diversos tipos de marcadores genéticos, conduziu a genética forense a uma utilização mais frequente dos polimorfismos de nucleotído único (SNPs). Iniciaram-se, também, as análises denominadas Forensic DNA Phenotyping (FDP) que incluem a inferência da ancestralidade biogeográfica (BGA) e a inferência das características visíveis externamente (EVC) a partir de uma amostra biológica. Características que poderão orientar a investigação e a pesquisa em registos, dotando o ADN da capacidade de atuar como testemunha. No entanto, a interpretação de genótipos e haplótipos de BGA pode ser desafiadora, faltando ainda, orientações e harmonização sobretudo sobre a forma de expor os resultados obtidos. Este trabalho tem como objetivos apresentar o método desenvolvido no Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Sul (SBGF-S) para a determinação dos marcadores BGA e EVC; e apresentar um modelo de relatório pericial que pretende explanar os procedimentos a que a amostra foi submetida e traduzir os resultados em conclusões adequadas e percetíveis. Foram analisadas amostras colhidas após consentimento informado livre e esclarecido aprovado pela comissão ética e científica do INMLCF. As amostras foram extraídas com PrepFiler Express BTA™ Forensic DNA Extraction Kit e quantificadas com Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit. A preparação de bibliotecas de 41 SNPs autossómicos informativos para a EVC, 163 SNPs autossómicos de ancestralidade, e 116 Y-SNPs específicos de linhagem paterna incluídos no Ion AmpliSeq™ PhenoTrivium Panel, foi realizada de forma manual. A preparação de bibliotecas de ADN mitocondrial (ADNmt) foi realizada num equipamento Ion Chef™ com o Precision ID mtDNA Whole Genome Panel. A preparação do template e carregamento do Ion 530™ Chip foi realizada num Ion Chef™ utilizando o Ion S5™ Precision ID Chef & Sequencing Kit. A sequenciação foi realizada num Ion GeneStudio™ S5 System. A análise primária da sequência detetada foi realizada no Servidor Torrent em relação ao genoma de referência, hg19. A tipagem genética foi realizada utilizando o plugin HIDGenotyper-2.2 e a previsão BGA foi determinada com o Converge™ Software, baseada num método de bootstrap e um intervalo de confiança de 95%. A população de referência utilizada, compreende sete populações da base de dados ALFRED: África, América, Leste Asiático, Europa, Oceânia, Sul da Ásia e Sudoeste Asiático. A ancestralidade paterna e materna foi determinada recorrendo ao software YLeaf e à base de dados EMPOP, respetivamente. A predição do fenótipo foi obtida usando o Erasmus HPS Webtool. O conjunto dos SNPs autossómicos de ancestralidade, SNPs específicos de linhagem paterna e materna, e SNPs autossómicos fenotípicos, escolhidos, mostraram-se adequados para a determinação da BGA e EVC de uma amostra desconhecida, tendo sido elaborado o relatório pericial modelo.
- Identificação genética de pessoas desaparecidas em Portugal: desafios na resolução de casosPublication . Minervino, Aline; Bogas, Vanessa; Cardoso, Paula; Cainé, Laura; Amorim, António; Real, F. Corte; Brito, PedroA genética forense, com recurso às bases de dados de ADN, pode ser uma ferramenta poderosa para identificar pessoas desaparecidas, através da associação de cadáveres a amostras de referência de pessoas desaparecidas ou familiares das mesmas. Embora outros métodos de identificação possam ser aplicados, a tipagem de ADN emergiu como uma ferramenta valiosa para identificar restos humanos ao possibilitar a detecção de coincidências genéticas. A importância das Bases de Dados de Perfis de ADN na identificação de pessoas desaparecidas é inquestionável. No entanto, para que sejam eficazes, devem incluir perfis genéticos de pessoas ou cadáveres não identificados e perfis genéticos de referência para identificação civil, em especial amostras de referência de pessoas desaparecidas ou familiares. Um passo fundamental para otimizar o uso da BDADN é potenciar a inserção de perfis genéticos de familiares de desaparecidos. Portanto, a eficácia do uso da BDADN para identificação civil começa com uma maior conscientização da população sobre seu potencial para identificação de pessoas desaparecidas. Para isso, as Nações Unidas recomendam que campanhas de educação e informação eficazes sejam projetadas e implementadas em níveis local e nacional. As Bases de Dados de Perfis de ADN, além de servirem aos interesses de segurança pública, desempenham um papel importante na abordagem de questões relacionadas à dignidade humana, especialmente na identificação de pessoas desaparecidas. A identificação bem-sucedida através de coincidências genéticas depende da disponibilidade de amostras de referência de familiares de desaparecidos. Este trabalho analisa o uso atual da Base de Dados de Perfis de ADN (BDADN) para a identificação de pessoas desaparecidas e propõe maior conscientização e promoção dessa ferramenta. Assim, procede-se ao levantamento e estudo da contribuição deste ficheiro da BDADN para a identificação de desaparecidos, comparando com outras realidades internacionais, bem como estratégias seguidas para uma maior efícácia desta forma de identificação. Considerando que as investigações de pessoas desaparecidas dependem de esforços colaborativos e coordenados entre várias entidades nacionais, as instituições públicas relacionadas com a identificação civil devem incorporar o uso da BDADN nas estratégias adotadas na investigação. A otimização da integração entre as instituições pode aumentar o potencial da BDADN como ferramenta para auxiliar na identificação civil. O objetivo final deste processo é comum a todos: fornecer respostas às famílias de pessoas desaparecidas.