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- Aplicação do Powerplex Y System no estudo de casos de agressão sexualPublication . Vieira da Silva, Cláudia; Cruz, C.; Ribeiro, Teresa; Lucas, Isabel; Espinheira, R.O cromossoma Y é especificamente masculino, haploide e transmitido de pai para filho sem alterações, a menos que tenham ocorrido mutações A maior vantagem do estudo dos STRs do cromossoma Y, em contraste com os STRs autossómicos é a amplificação selectiva do ADN masculino. Os STRs do cromossoma Y têm propriedades de utilidade forense especialmente quando aplicados em vestígios biológicos provenientes de casos de agressão sexual, em que um suspeito masculino está envolvido, o que acontece praticamente na totalidade dos casos. Diversas metodologias são aplicadas desde há longa data no estudo de vestígios biológicos provenientes de agressões sexuais, como a pesquisa de espermatozóides, a pesquisa de esperma pela reacção de Fosfatase Ácida e o estudo do gene homólogo da Amelogenina Da amplificação desta região dos cromossomas sexuais resultam fragmentos com 106 pb do cromossoma X e 112 pb do cromossoma Y, mas, se o material biológico feminino estiver em muito maior quantidade que o masculino, ao realizar o estudo da Amelogenina pode ser difícil detectar o cromossoma Y. Neste estudo com aplicação do Powerplex® Y System detecta se de forma inequívoca a presença de material genético de origem masculina, obtendo se um perfil genético ou haplotipo que poderá ser comparado com o dos suspeitos. Este kit está comercialmente disponível e validado e permite a amplificação simultânea de 12 Y STRs DYS 19 DYS 385 a/b, DYS 389 I, DYS 389 II, DYS 390 DYS 391 DYS 392 DYS 393 DYS 437 DYS 438 DYS 439.Nos casos de agressão sexual, o ADN autossómico do agressor pode surgir mascarado com o da vítima conduzindo a uma “sobrerepresentação”do perfil genético da mesma Q uando os vestígios biológicos do agressor estão presentes em muito pequena quantidade e os resultados da fosfatase ácida para pesquisa de esperma são negativos, a pesquisa de Y STRs pode ser um complemento fundamental para a prova de que existe nas amostras estudadas material genético de origem masculina . A pesquisa de Amelogenina pode não ser a forma mais eficiente de comprovar a presença de material biológico masculino Nos casos em que a presença de material biológico masculino é escasso comparativamente ao da vítima (figura 2 ou quando ocorre delecção no gene da Amelogenina do cromossoma Y do agressor, este pode não ser detectado na análise de fragmentos, Nos casos em que se pode comparar o perfil genético das amostras com o perfil do suspeito, o estudo dos STRs autossómicos pode ser difícil de interpretar numa mistura de material biológico, sobretudo se estiver envolvido mais do que um suspeito O estudo dos Y STRs nestas amostras permite excluir imediatamente o(s) suspeito(s) se o perfil genético ou haplótipo não for coincidente. Se ocorrer coincidência dos resultados os restantes membros da mesma linha paterna não podem ser excluídos .Quando a vítima é um indivíduo do sexo masculino os resultados obtidos também são válidos, sendo possível identificar o perfil genético do agressor conhecendo o perfil genético da vítima, desde que não pertençam à mesma linha paterna.O Kit Powerplex®Y system poderá ser uma ferramenta muito útil para detectar quantidades mínimas de ADN masculino nas amostras recomendando se a sua utilização nos casos de agressão.
- Contribuição do Y-DNA na identificação de agressoresPublication . Vieira da Silva, Cláudia; Dario, Paulo; Ribeiro, Teresa; Lucas, Isabel; Cruz, C.; Espinheira, R.Os loci do cromossoma Y (Y-STRs) têm sido extensivamente investigados em ciências forenses para identificação de indivíduos do sexo masculino. A aplicação dos Y-STRs, simplifica a análise de misturas, por apenas permitir a amplificação do material genético masculino do s vestígios biológicos. “Y-STR testing” tem sido considerada uma ferramenta adicional valiosa em casos que envolvem misturas de grandes quantidades de DNA feminino com pequenas quantidades de DNA masculino ou/e em casos de múltiplos dadores de sémen. A aplicação dos Y-STRs em análises de misturas evita a necessidade de realizar uma extracção diferencial de esperma e de células epiteliais. Estes procedimentos de extracção têm um valor limitado em amostras com contribuições masculino/feminino desbalanceadas ou em restos de fluidos biológicos sem espermatozóides.Apesar do baixo poder de discriminação dos Y-STRs e de todos os indivíduos da mesma linha paterna, neste estudo ficou demonstrado que em casos forenses a análise dos Y-STRs é indispensável devido à especificidade de amplificação genética da componente masculina de uma amostra biológica. Em alguns casos em que a quantidade de material masculino é insuficiente para ser detectado um perfil completo com os sistemas do haplotipo mínimo (9 loci), mesmo não sendo estes sistemas suficientes para afirmar que a amostra do suspeito coincide com a da vítima poderemos afirmar que um indivíduo pode ser excluído de ser contribuinte de algum vestígio biológico, se não existir existir coincidência entre alguma das características genéticas do suspeito e as características genéticas dos vestígios encontrados. Os resultados obtidos demonstram que todas as amostras dos casos de violação devem ser estudados com sistemas multiplex de grande sensibilidade de Y-STRs. A presença de Y-DNA constitui prova de contacto sexual sendo importante para corroborar o testemunho das vítimas de abuso sexual.
- Identificação Genética de Amostras Utilizadas na Determinação da Taxa de AlcoolemiaPublication . Cruz, C.; Vieira da Silva, Cláudia; Ribeiro, Teresa; Lucas, Isabel; Espinheira, RosaA condução sob influência de álcool é responsável por grande parte da sinistralidade rodoviária e a sua fiscalização tem constituído uma das medidas de prevenção dessa sinistralidade. A determinação da Taxa de Alcoolémia no Sangue (TAS) é um dos meios utilizados na fiscalização. No Serviço de Genética e Biologia Forense da Delegação de Lisboa ocorreram solicitações de identificação genética de amostras previamente utilizadas na determinação de TAS.A identificação genética consiste no estudo do perfil de ADN obtido a partir das referidas amostras e na posterior comparação com o perfil de ADN obtido a partir de amostras biológicas de referência, colhidas ao indivíduo sujeito a pesquisa de álcool ou, no caso de falecimento deste, com o perfil genético de familiares directos. Este trabalho descreve os procedimentos realizados na identificação genética das referidas amostras. A comparação dos perfis genéticos obtidos permitiu detectar coincidência/não coincidência ou presença/ausência de uma relação de parentesco entre os referidos perfis e, consequentemente, determinar a identidade da amostra.Este tipo de estudo pode constituir um importante complemento às provas estabelecidas para a detecção do estado de influenciado pelo álcool ou por substâncias estupefacientes ou psicotrópicas.
- Vestígios Biológicos na Pele da VítimaPublication . Cruz, C.; Lucas, Isabel; Vieira da Silva, Cláudia; Dario, Paulo; Ribeiro, Teresa; Espinheira, RosaO estudo de DNA, em crimes de agressão/abuso sexual, constitui uma ferramenta de extrema importância para identificar o agressor. Os critérios utilizados na colheita dos vestígios biológicos, a partir do corpo da vítima, podem influenciar a obtenção de resultados laboratoriais que permitam o esclarecimento dos factos ocorridos. Os erros involuntariamente cometidos podem conduzir a uma perda irremediável das evidências. Durante o exame clínico efectuado às vítimas, são habitualmente colhidas amostras de diferente natureza, tais como: esxudado vaginal, anal e bucal (em zaragatoa ou lâmina); papel e pensos higiénicos; peças de roupa.Pretende-se, com este trabalho, realçar a utilidade da recolha de vestígios biológicos a partir da superfície da pele das vítimas de abuso sexual para a resolução deste tipo de casos, uma vez que podem constituir um importante meio de prova.A presença de sémen e/ou espermatozóides em amostras forenses tem sido considerada a evidência necessária para provar a existência de contacto sexual. Relativamente ao Caso 1, a observação microscópica das lâminas de esfregaço de “lavado” da mama não revelou presença de espermatozóides. No entanto, o estudo de Y-STRs a partir da zaragatoa de “lavado” da mama permitiu a detecção de um perfil genético, o que constitui um indício de contacto físico entre a vítima e o agressor. É de salientar ainda o facto de, neste caso, a referida zaragatoa ter sido a única amostra que apresentou vestígios biológicos masculinos, o que demonstra a importância da colheita de vestígios biológicos a partir da superfície da pele das vítimas de abuso sexual para a resolução deste tipo de casos, podendo constituir um importante meio de prova.
- Diversidade Genética na População de Macau em 15 Loci STRsPublication . Cruz, Carla; Viriato, Luís; Vieira, Claudia; Ribeiro, Teresa; Espinheira, Rosa; Geada, HelenaDecorridos 450 anos de permanência de população portuguesa em território macaense, no dia 20 de Dezembro de 1999, teve lugar a transferência definitiva da soberania de Macau para a República Popular da China. Tendo como objectivo a caracterização genética de uma população originária e residente em Macau e posterior comparação com a população portuguesa, foi efectuado um estudo de um conjunto de 15 loci STRs, dos quais 13 constituem o sistema CODIS e 2 são pentanucleótidos (Penta E e Penta D)A população de Macau mostrou desvios do equilibrio de Hardy-Weinberg nos sistemas D3S1358, TH01, D8S1179, D16S539 e PENTA D, apresentando neste último o desvio mais significativo. Verifica-se que o locus PENTA E é o mais polimórfico e discriminante na população em estudo. A comparação da população macaense com a população portuguesa revelou alelos exclusivos da primeira nos sistemas D18S51 (alelo 24), PENTA E (alelo 24), D5S818 (alelo 7), D7S820 (alelo 9.1), CSF1PO (alelos 14 e 15), vWA (alelo13) e FGA (alelos 13, 16, 25.2 e 26.2). No sistema TPOX a distribuição das frequências alélicas é muito próxima da população portuguesa. Em relação a todos os outros loci, foram detectadas diferenças significativas das frequências dos alelos entre as duas populações. Comparando a população macaense com populações chinesas2,3, verifica-se que estas apresentam semelhanças quanto à distribuição dos alelos nos sistemas estudados, o que sugere proximidade entre as referidas populações.
- Identification by mtDNA of exchanged human body remainsPublication . Cruz, Carla; Ribeiro, Teresa; Vieira - Silva, Cláudia; Lucas, Isabel; Geada, Helena; Espinheira, RosaMtDNA offers some advantages over genomic DNA markers for the identification of human remains. Its sequence is completely determined and the high copy number increases the chance to obtain mtDNA in cases of limited quantity or degraded autosomal DNA. The maternal mode of inheritance without recombination during the meiosis process allows maternal lineage identification by a simple direct comparison of the mtDNA sequence of mother and child or between brothers and sisters. CASE HISTORY: Five Portuguese citizens were killed in African. Three of them were identified and removed to Portugal, where they were buried. Two children were reported as missing. One year later, two skeletons were found in a grave 500 metres from the crime scene. Genetic typing of DNA extracted from skeletal remains was performed in order to establish their identities. One of the mothers of the two missing minors was excluded from the maternity of the skeletal remains. The hypothesis was raised of an identity exchange of the three corpses previously removed to Portugal. These were then exhumed and subjected to genetic analysis to achieve biological identification. Although teeth and bones are reliable sources of DNA, it was difficult to obtain results namely from those retrieved in Africa. As we expected, these required more modifications to standard protocol. The state of the bones samples from this continent was poor, probably due to the humidity, temperature and other African environmental conditions and soil characteristics that accelerate the degradation process. Low amounts, high fragmentation, and contamination of the DNA are the main problems associated with this kind of sample. In some cases, increasing the amount of DNA helped to overcome the first problem, but in some others lead to negative results, which can be explained by an increase of Taq polymerase inhibitors in the mix reaction. Regarding the degraded DNA, the application of different primers to the HVI and HVII regions allowed the amplification of two shorter overlapping fragments for each region and the reconstruction of HVI and HVII sequences. Several dilutions of DNA extract were tested to decrease the hypothetical contaminants that would act as Taq polymerase inhibitors. The coincidence of each of the five body sequences with one of the alleged mothers suggests a maternal relationship. A fraternal relationship was detected between bodies 2 and 5. These share the same mtDNA sequence with mother 3. The results supported the hypothesis of exchanged human body remains. Autosomal STR loci analysis was performed and confirmed the identity of the human remains. MtDNA analysis was a useful tool to solve this case. Although it cannot be used to definitely identify the corpses, it provided evidence of a maternal relationship and, consequently, the exchange of human body remains.
- 16 Y-Specific STR Analysis in Human Remains IdentificationPublication . Vieira-Silva, Cláudia; Cruz, C.; Ribeiro, Teresa; Lucas, Isabel; Geada, H.; Espinheira, R.Forensic investigation often requires the use of degraded biological material, especially for determining the identity of human remains. Y-STRs, offer new perspectives for identification and kinship analysis especially on forensic deficiency cases 1 in complement of autosomal STRs. The non-recombining portion of the Y-chromosome is of value providing additional data in paternal lineage identification. The aim was the study of 16 Y-STR loci to perform human remains identification - the minimal Y-STR haplotype - DYS19, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS19, DYS389I/II, DYS385 – and – GATA A .1(DYS460), GATA A 7.2 (DYS461), GATA C4, GATA H4, DYS437, DYS438, DYS439 loci, that are part of the Y-chromosome quality control Group of the Spanish and Portuguese Group (GEPY) of the ISFG. Y-STR typing in degraded biological material has major technical challenges since each sample has unique characteristics. The best results were obtained in autopsy bloodstains may be due to the fact that the autolysis mechanisms are still incipient. Otherwise blood kept at 4º C for more than a year didn’t provide the same good results. Liquid blood samples from deceased individuals may contain porfirinic compounds from hemoglobin, powerful PCR inhibitors difficult to eliminate9. In bone and teeth samples the source of inhibitors may be a high amount of DNA from other micro-organisms such as bacteria and fungi which invade bone9 and probably this kind of contaminants can explain some of the results obtained in bones and teeth samples submitted to prolonged humidity, temperature environmental conditions and also adverse soil characteristics. The problem with the studied samples seems not to be DNA quantity but the out-of-control presence of inhibitors that interfere not only with the extraction but also with the amplification process because most of the results were obtained with a dilution of DNA extraction and adding more Taq, sometimes 2 or 3 fold. With these samples, it seems that the success or failure depends on each sample itself and it should be treated individually. The number of distinct factors connected to each sample is difficult to calculate, so it is necessary to make a few attempts in order to have as many results as possible.
- vWA STR Locus - Structure and variabilityPublication . Cruz, Carla; Vieira da Silva, Cláudia; Lucas, Isabel; Ribeiro, Teresa; Espinheira, Rosa; Geada, HelenaThe biological individualization of samples is studied through DNA STR loci analysis and is the principal goal of Forensic Genetics. STR loci study was initiated in the 90s on the majority of Forensic Laboratories. vWA is one of the most studied STR loci all over the world. It is included in any STR set proposed by Forensic Groups as the 13 core loci of the CODIS System used in routine cases by most Forensic Genetic Laboratories. When performing paternity investigation and identification cases with STR loci, once in a while we came through rare or new alleles. Sequencing is essential to confirm the structure of these alleles. Also in mutation cases, especially in primer binding mutation cases, allele sequence should be performed. The high primer binding mutation observed in this locus and the interest in structure analysis of rare alleles observed in certain population groups were the main reasons for performing vWA sequence. More than one hundred vWA samples have been sequenced with DNA Sequencing Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing with forward and reverse primers (Kimpton et al, 1992 GenBank M25858). Sequencing was performed in an ABIPRISM 377 DNA Sequencer and analyzed by Sequencing Analysis. In this study we will present the structural analysis of vWA alleles from allele 11 to allele 22 studied in two main populations – a Portuguese population and an African population mainly from Cabo Verde Islands and Angola
- Portuguese Population Study with 16 Y-STR LociPublication . Geada, Helena; Baptista, Joana; Felgueiras, Miguel; Vieira Da Silva, Cláudia; Cruz, Carla; Lucas, Isabel; Ribeiro, Teresa; Espinheira, RosaAlthough autosomal STRs are commonly used for forensic investigations, Y-chromosome STRs provide very useful information in paternity investigation cases without alleged father and investigation cases where paternal lineage identification can be assessed. The aim of this study is to present an extended 16 Y-STR Portuguese Population Database of 214 Southern Portugal individual samples for forensic purpose, including the 8 Y-STR minimal haplotype – DYS19, DYS389 I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS385 (Gusmão et al, 2001, D Syndercomb-Court, personal communication) and Y-STR loci included in the Y-Chromosome GEP-ISFG collaborative exercise – DYS437, DYS438, DYS439, DYS460, DYS461, GATA A10, GATA C4, GATA H4.When performing a 16 Y-STR study the genetic diversity was successfully increased. With the 8 Y-STR minimal haplotype, haplotype clusters can be detected involving several non-related individuals, whereas, with a 16 Y-STR haplotype, haplotype clusters involve only 2 or 3 non-related individuals. The 16 Y-chromosome STR haplotype seem to be extremely important to solve complex forensic cases and in population, studies to obtain unique paternal profiles and to determine specific population characteristics
- Avaliação da aplicação do software Euroformix-Casesolver na interpretação e valorização estatística de misturas complexas em casos criminaisPublication . Vieira Da Silva, Cláudia; Ribeiro, Teresa; Amorim, António; Carvalho, MónicaOs Kits comerciais de amplificação de STRs autossómicos para aplicação forense permitem obter informação genética com grandepoder de discriminação. Atualmente os kits mais recentes permitem obter poderes de discriminação que variam entre 1 x 10E18 (para 15 STRs autossómicos) e 1 x 10E26 (para 21 STRs autossómicos). Um número crescente de loci, contribui para que esse poder de discriminação aumente infinitamente. Por outro lado, os desenvolvimentos ao nível da bioquímica têm resultado na deteção de concentrações muito baixas de ADN, tipicamente descritas como amostras com baixa concentração, e posterior obtenção de perfis genéticos em vestígios biológicos, onde há pouco tempo atrás era quase impossível obter esses resultados. A obtenção de perfis genéticos, não pode ser dissociada da valorização estatística da respetiva prova pericial. Existem alguns softwares estatísticos disponíveis, entre os quais o “Euroformix-casesolver” e o LRMix, com modelos de cálculo distintos com aplicação na avaliação estatística dos casos criminais. A principal vantagem do “Euroformix-casesolver”, comparativamente aos softwares disponíveis, consiste na utilização da informação relativamente à intensidade de sinal do produto amplificado (altura em RFUs) e deste modo permite introduzir no cálculo a informação desta variável, avaliada até à presente data, de forma qualitativa. Este trabalho tem como objetivo a comparação de resultados de valorização da prova em casos forenses complexos com o Euroformix – Casesolver e LRMIX Studio. Foram selecionados três perfis genéticos de mistura, provenientes de casos complexos de investigação criminal com perfis genéticos de vítima e suspeito. Pretende-se efetivamente demonstrar que o “Euroformix-Casesolver” é uma ferramenta de cálculo muito eficaz e adequada para aplicação nos casos criminais forenses, sobretudo nos casos de misturas complexas em particular os que envolvem familiares.