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- Implementação da deteção molecular de SARS-CoV-2 na Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências ForensesPublication . Fadoni, Jennifer; Magalhães, Jéssica; Cerqueira, Joana; Cainé, Laura; Amorim, AntónioA Doença do Coronavírus 2019, causada pelo vírus SARS-CoV-2, foi classificada como uma pandemia pela OMS em 11 de março de 2020. Até julho de 2023, foram registados mais de 768 milhões de casos, com mais de 6,9 milhões de mortes associadas. O objetivo do Laboratório de Virologia e de Análises Clínicas e Forenses da Delegação do Norte (LVACF-N) foi implementar a análise de deteção molecular de SARS-CoV-2 na Delegação do Norte do INMLCF, pois a deteção de casos de infeção por SARS-CoV-2 é de extrema importância para controlar a transmissão da infeção, o que por sua vez permite minimizar o impacto da COVID-19 na população e na demanda dos serviços públicos de saúde. A implementação da deteção molecular de SARS-CoV-2 na Delegação do Norte foi dividida em três etapas: i) Validação da metodologia de análise no equipamento de RT-PCR presente na Delegação do Norte, utilizando primers desenhados in house; ii) Avaliação do limiar de deteção do genoma viral; e iii) Validação do novo equipamento de RT-PCR adquirido para o LVACF-N, utilizando um kit comercial e também primers desenhados in house. Na fase I, foram realizadas análises de deteção molecular de SARS-CoV-2 em 61 zaragatoas nasofaríngeas colhidas post-mortem, utilizando primers desenhados in house. Os resultados foram comparados aos resultados de uma entidade externa, e foram obtidos valores de sensibilidade e especificidade iguais a 100%. Na fase II, foi possível detetar o genoma viral com uma concentração ínfima de 0,25 cópias/uL. Na fase III, foi avaliada a reprodutibilidade da análise no RT-PCR CFX96™ System em 30 amostras, utilizando primers desenhados in house e um kit comercial. Os resultados foram comparados aos resultados do equipamento validado na fase I, e não foi encontrada nenhuma divergência. Após a validação dos métodos e dos equipamentos, as análises de deteção molecular de SARSCoV- 2 em amostras colhidas post-mortem pelo Serviço de Clínica e Patologia Forense da Delegação do Norte, passaram a ser realizadas pelo LVACF-N. Entre 31/03/2023 e 21/07/2023, foram processadas 261 amostras, das quais 245 (93,87%) apresentaram resultado “negativo”, 12 (4,60%) “positivo” e 4 (1,53%) “indeterminável”; 177 (67,82%) foram colhidas em cadáveres do sexo masculino, 82 (31,42%) do sexo feminino, e 2 (0,76%) em cadáveres cujo sexo não foi identificado. A média de idade dos indivíduos foi de 63,25 anos, com valores entre 2 e 96 anos de idade. Em um curto intervalo de tempo, o LVACF-N validou metodologias e equipamentos, o que permitiu que as análises de deteção molecular de SARSCoV- 2 em amostras colhidas post-mortem pelo Serviço de Clínica e Patologia Forense desta Delegação, passassem a ser processadas internamente. Assim sendo, o LVACF-N aumentou a capacidade de autossuficiência do INMLCF, reduziu custos, possibilitou um maior aproveitamento de recursos, e pavimentou o caminho para a realização de outros tipos de análises de deteção molecular, a serem realizadas pelo LVACF-N num futuro próximo.
- In house Real-Time PCR multiplex for simultaneous detection of human influenza A and B virus and respiratory syncytial virusPublication . Fadoni, Jennifer; Cainé, Laura; Rodrigues, Joana; Mofreita, Vânia; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Corte Real, F.; Amorim, António
- Hepatitis A: Ultrasensitive enzyme-linked fluorescence assay in occasional detection of prior contact in a medico-legal sample In LisbonPublication . Mofreita, Vânia; Cainé, Laura; Rodrigues, Joana; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Fadoni, Jennifer; Corte Real, F.; Amorim, António
- Next Generation Sequencing for variant detection of SARS-CoV-2 in a medico-legal context in the second year of the PandemicPublication . Rodrigues, Joana; Cainé, Laura; Mofreita, Vânia; Nascimento, Rui; Mukan, Olena; Fadoni, Jennifer; Corte Real, F.; Amorim, António
- Transmissão de HIV no âmbito de crimes de agressão sexualPublication . Amorim, António; Mofreita, Vânia; Rodrigues, Joana; Corte Real, F.; Cainé, Laura
- Deteção molecular de infeções virais respiratórias na Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências ForensesPublication . Fadoni, Jennifer; Cainé, Laura; Amorim, AntónioOs testes moleculares desempenham um papel crucial na deteção precoce e no controle de infeções virais. No contexto forense, os testes moleculares de deteção viral são de extrema importância, pois permitem a identificação precisa de infeções virais que podem ter contribuído para a morte de um indivíduo. Esse diagnóstico post-mortem é crucial não apenas para determinar a causa da morte em casos suspeitos ou em surtos de doenças, mas também para proteger os profissionais que manipulam os corpos, garantindo que medidas de biossegurança adequadas sejam adotadas. Além disso, os resultados desses testes fornecem dados valiosos para a vigilância epidemiológica, ajudando a monitorar a disseminação de doenças e a implementar estratégias de saúde pública eficazes. O Laboratório de Virologia e de Análises Clínicas e Forenses (LV-ACF) da Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) realiza testes de deteção molecular do vírus de SARS-CoV-2 em amostras colhidas post-mortem de todos os cadáveres cuja autópsia é realizada pelo Serviço de Clínica e Patologia Forense da Delegação do Norte (SCPF-N) do INMLCF. O objetivo desse trabalho é apresentar e analisar os dados referentes aos testes de deteção viral realizados pelo LV-ACF ao longo de um ano, visando contribuir para a melhoria das estratégias de prevenção e controle de doenças virais. Entre 15/06/2023 e 15/06/2024, o LV-ACF da Delegação do Norte do INMLCF realizou 1113 testes de deteção molecular de material genético viral, a partir de zaragatoas nasofaríngeas colhidas post-mortem pelo SCPF-N, nomeadamente 741 testes de deteção molecular de SARS-CoV-2, dos quais 32 (4,32%) apresentaram resultado positivo e 24 (3,24%) apresentaram resultado indeterminável; 124 de deteção molecular de Gripe A, Gripe B e Vírus Sincicial Respiratório, dos quais 5 (4,03%) apresentaram resultado positivo para Gripe A. Não foi detetado nenhum caso de gripe B ou Vírus sincicial respiratório. A idade média dos indivíduos testados foi de 62 anos, com idades compreendidas entre 14 a 96 anos. Relativamente aos casos com resultado positivo, a idade média dos indivíduos com resultado positivo para SARS-CoV-2 foi de 67 anos, com idades compreendidas entre 25 e 95 anos. Em relação aos casos de Gripe A, a idade média dos indivíduos foi de 60 anos, com idades compreendidas entre 31 e 75 anos. Este amplo intervalo etário indica que as infeções virais não se restringiram a uma faixa etária específica, afetando tanto indivíduos jovens quanto idosos. O trabalho realizado pelo LV-ACF é fundamental para a vigilância epidemiológica, ajudando a identificar padrões de infecção e a orientar políticas de saúde pública. Além disso, fornece dados essenciais para a proteção dos profissionais de saúde e a implementação de medidas preventivas eficazes, especialmente em populações vulneráveis. A continuidade desses testes é crucial para uma resposta rápida e informada a surtos de doenças virais.
- Implementação da autópsia molecular utilizando Sequenciação de Nova Geração (NGS) no Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências ForensesPublication . Fadoni, Jennifer; Shastakova, Alena; Cainé, Laura; Santos, Agostinho; Amorim, AntónioA morte súbita cardíaca (MSC) pode ser causada por diversas patologias cardíacas, e na população jovem, geralmente é causada por cardiomiopatias e arritmias, que possuem uma base genética. Nestes casos, o indicado é que sejam realizados testes genéticos post-mortem, também conhecidos como autópsia molecular, cujo objetivo é identificar a causa genética que levou à morte. A sequenciação de nova geração (NGS) permite a análise de grandes regiões genómicas de forma rápida e gera uma grande quantidade de informação, sendo uma ferramenta eficaz na determinação das causas moleculares que levaram à morte, e na identificação de biomarcadores que devem ser investigados nos familiares diretos da vítima de MSC. O objetivo do Laboratório de Virologia e de Análises Clínicas e Forenses (LV-ACF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, INMLCF, foi implementar a aplicação da NGS na análise de amostras biológicas colhidas post-mortem, a cadáveres cuja autópsia médico-legal foi realizada pelo INMLCF e classificada como inconclusiva, com vista a determinar a etiologia molecular de cardiomiopatias e arritmias, utilizando a Sequenciação de Nova Geração para identificar variantes genéticas associadas a estas condições cardíacas. Após a validação dos métodos e dos equipamentos, as autópsias moleculares a partir de amostras colhidas post-mortem pelo INMLCF passaram a ser realizadas pelo LV-ACF, através da utilização de um painel de 62 genes associados a arritmias, e 82 genes associados a cardiomiopatias, num total de 125 genes. Assim, o LV-ACF dotou o INMLCF de capacidade e autonomia no âmbito das autópsias moleculares cardiacas, reduziu custos, possibilitou um maior aproveitamento de recursos, e encetou o caminho para a realização de outros tipos de análises no âmbito da Genética médico-legal, a serem realizadas pelo LV-ACF num futuro próximo.
- Metodologias para preparação e extração de ADN de fragmentos humanos antigos: uma revisão preliminarPublication . Franco, Magda; Correia Dias, Helena; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO Laboratório de ADN Antigo do Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) tem como objetivo, entre outros, analisar fragmentos humanos antigos (ossos e dentes). Pretende assim, através de análises genéticas, contribuir para estudos relacionados com a evolução de populações antigas humanas, assim como a sua relação com a população atual. A reduzida quantidade de ADN e o elevado nível de degradação são dois dos desafios mais comuns quando se trabalha com ADN antigo (aDNA). É crucial diferenciar o ADN exógeno do aDNA autêntico, visto que estas amostras estão sujeitas a contaminações ambientais e humanas. Tendo em conta a pouca qualidade esperada das amostras, será mais eficaz o estudo do ADN mitocondrial (mtDNA) do que do ADN nuclear, já que o mtDNA está presente nas células num maior número de cópias e apresenta uma configuração molecular circular fechada, que resulta numa maior proteção. Por outro lado, como este ADN é herdado apenas por via materna, o seu estudo não é muito utilizado nas identificações individuais, mas é uma fonte importante de ADN para realizar estudos populacionais, sendo que nos permite obter informações sobre as linhagens maternas dos indivíduos. De acordo com a literatura, os métodos de pré-processamento usados antes da extração de ADN podem afetar a autenticidade e a quantidade de ADN obtido. Várias técnicas de pré-tratamento são utilizadas atualmente, tais como, limpeza da superfície do osso com lixívia, seguido de limpeza com água e, por fim, com etanol. Também é utilizada luz UV para garantir que o ADN extraído será autêntico e não de fontes exógenas. Em análises forenses, os dentes e ossos são normalmente reduzidos a pó para a extração de ADN. Tem sido também demonstrado que é possível obter bons resultados com um método diferente -"scrapping"-, sendo que esta técnica preserva melhor a amostra. No entanto, é necessário avaliar a idade, o estado e o nível de degradação do osso/dente, sendo que amostras frágeis podem ser quebradas facilmente, mesmo com este método. Na fase de extração, existem vários métodos que podem ser usados: métodos baseados em colunas (rápidos,mas produzem pouca quantidade de ADN); e métodos baseados em sílica, precipitação e microfiltros (demorados e trabalhosos, mas produzem melhores resultados). Também existe o método de fenol-clorofórmio (ainda de referência e utilizado por vários anos), que é trabalhoso e envolve riscos para o operador. Em suma, é importante fazer uma revisão dos métodos mais adequados para o tratamento e extração destas amostras difíceis, tendo em conta a manutenção da integridade das mesmas, para que possam ser utilizadas em investigações futuras ou expostas em museus. Assim, esta revisão serve como um primeiro passo para a implementação das metodologias mais adequadas para a obtenção de aDNA autêntico de restos humanos antigos para estudos futuros no Laboratório de ADN Antigo do INMLCF.
- ADN antigo: perspetivas e desafiosPublication . Correia Dias, Helena; Franco, Magda; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO DNA antigo (aDNA) pode ser uma fonte crucial de informação para estudos sobre a evolução e história das populações, revelando aspetos importantes, como migrações e interações humanas. Desde o primeiro estudo baseado no isolamento de aDNA, em 1984, novos desafios e oportunidades surgiram na área. Ao longo dos anos, com as melhorias técnicas nos métodos de extração de ADN e a emergência de novas metodologias de sequenciação de alto rendimento, como massive parallel sequencing, foram também impulsionadas novas perspetivas neste campo. Os restos humanos antigos, provenientes de escavações arqueológicas e de coleções museológicas, podem ser difíceis de analisar, principalmente devido à contaminação por ADN moderno, à degradação e exiguidade do aDNA, à contaminação laboratorial, ao armazenamento incorreto, às condições ambientais, entre outros. Além disso, apesar de muitos métodos de pré-tratamento terem sido propostos, poucos estudos relatam a preservação da estrutura e integridade do espécime. Os ossos e dentes são, muitas vezes, a única evidência da existência de um indivíduo ou população e devem ser analisados, mas essencialmente preservados. A análise de aDNA consiste, resumidamente, na preparação da amostra (usando, preferencialmente, um método não invasivo), extração de ADN, quantificação de ADN, PCR e sequenciação. O processo de preparação da amostra é determinante devido às características particulares do aDNA, como a baixa quantidade e a extensa degradação. Uma das questões mais importantes é a autenticidade do aDNA, sendo essencial minimizar o risco de contaminação por ADN moderno. Na extração de ADN, considerando amostras museológicas, é necessário selecionar um método não destrutivo, seguido de um método de quantificação preciso, que permita também otimizar a extração e detectar inibidores da PCR. A PCR deve também ter características específicas, comparando com a amplificação tradicional. Uma PCR dividida em dois passos é essencial para ultrapassar os artefactos do aDNA degradado. É aconselhável fazer múltiplas reações de PCR da mesma amostra e depois sequenciar as réplicas por sequenciação de Sanger. Após alinhamento e comparação das múltiplas sequências, a sequência de interesse é obtida. Recentemente, o Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro (SGBF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) criou um Laboratório de ADN Antigo com o objectivo principal de estudar amostras arqueológicas com diferentes intervalos post-mortem. Considerando que a análise de aDNA desempenha um papel crucial nos estudos arqueológicos e paleogenómicos, o objectivo da presente comunicação é divulgar e partilhar na comunidade científica o nosso novo Laboratório de ADN Antigo do INMLCF e mostrar o seu potencial para a expansão da investigação em aDNA, sendo que este laboratório está integrado num projecto científico que estuda comunidades da pré-história recente, na região centro de Portugal (MEDICE II).
- Post-mortem genetic investigation in sudden cardiac death victims: complete exon sequencing of forty genes using next-generation sequencingPublication . Fadoni, Jennifer; Santos, Agostinho; Cainé, Laura