Validação do Ensaio Investigator HDplex nos Laboratórios do Porto do SGBF - resultados preliminares

Magalhães, Paulo; Amorim, António; Ferreira da Silva, Benedita

http://hdl.handle.net/10400.26/59407

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Authors

Magalhães, Paulo

Amorim, António

Ferreira da Silva, Benedita

Abstract(s)

A identificação humana tem como base a Genética Forense, que assenta essencialmente no estudo de STR. Esta constitui uma das provas com maior relevância em contexto jurídico, sendo que a sua complexidade e importância exigem uma adaptação constante à disponibilização de novos kits. O Investigator HDplex é um kit que permite a amplificação 9 polimorfismos exclusivos, quando comparado com os kits em uso no SGBF: GlobalFiler Amplification Kit e PowerPlex Fusion 6C. A informação adicional fornecida pelo HDplex é, por vezes, essencial para uma conclusão pericial mais inequívoca nas Identificações Individuais e Investigações de Parentesco. Assim, e dado que o SGBF é um laboratório acreditado pelo IPAC, é necessário proceder a uma validação interna, de acordo com o PG-SGBF-001. Este trabalho pretende apresentar os procedimentos validados e os resultados obtidos até ao momento pelo SGBF-N. Material e Métodos Vários foram os parâmetros já analisados e determinados na validação do HDplex: especificidade, sensibilidade, limiares analíticos e análise de diferentes tipos de amostra e quantidade de reagente utilizado. O primeiro parâmetro estudado foi a determinação dos limiares analíticos, tendo, para tal, sido analisados 50 brancos de amplificação. Para a análise da especificidade foram analisadas 34 amostras de diferentes animais. As amostras utilizadas para a análise da sensibilidade apresentaram um intervalo de quantidade de ADN de 10-0,001ng/μL. De forma a otimizar recursos, foi testada a quantidade de reagente e número de ciclos do programa de amplificação. Foi reduzido o volume final de reação para metade do descrito na bula, assim como foi reduzido o número de ciclos para 27. Foram estudados diferentes tipos de amostras: zaragatoas bucais e manchas de sangue (cadáver e in vivo), com o objetivo de garantir e verificar a eficácia da amplificação em diversos contextos. Todas as amostras foram extraídas por PrepFiler e Prep-n-Go, e as manchas de sangue foram, ainda, amplificadas de forma direta. No procedimento laboratorial foram utilizados termocicladores GeneAmp PCR System 9700 e Veriti Thermal Cycler e o sequenciador 3500 Genetic Analyzer. Resultados e Discussão O kit HDplex revelou ser exclusivo para ADN humano, uma vez que não foi obtido qualquer perfil genético nas amostras de animal analisadas. Quanto à sensibilidade, verificou-se dropout alélico a partir de 0,05ng/μl. Na análise dos diferentes tipos de amostra, apesar da redução do número de ciclos, os eletroferogramas apresentaram ainda artefactos relativos a sobreamplificação. Desta forma, reduziu-se o input de amostra para 0,5μL, o que permitiu obter perfis genéticos que respeitam as normas da qualidade. Conclusões Os procedimentos realizados permitiram otimizar o uso do kit nas amostras de referência, pretendendo-se estender a validação às amostras de restos cadavéricos (e.g. osso). Assim, futuramente, pretende-se concluir o procedimento de validação, de forma que o kit possa ser utilizado sempre que necessário, estando abrangido pela acreditação.