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- UHPLC-MS/MS methodology for analysis of new synthetic opioids and hallucinogens in whole bloodPublication . Pereira, Joana; Antunes, Mónica; Neng, N.R.; Mustra, Carla; Franco, João; Fonseca, SuzanaBackground & Aims: New Psychoactive Substances (NPS) are a real contemporaneous threat, due to their potency, dangerousness, and lack of control/monitoring. The NPS group that has grown the most is the synthetic opioids group, where fentanyl and its analogues stand out. However, the emerging concerning synthetic opioids are nitazenes. Due to their high potency, even minimal consumption doses can lead to severe health effects or even fatal overdoses, making them a public health issue. Notwithstanding, is it also important to remain vigilant towards more “traditional” psychoactive substances like hallucinogens once they have been associated with both intentional and unintentional poisonings/intoxications. This is particularly relevant now that they are also being used for clinical purposes. Therefore, it is essential to establish analytical methodologies for monitoring these compounds. As a result, the aim of this study was to develop, optimize and validate an easy to use, fast, simple, sensitive, robust, and routine flow method for the analysis of new synthetic opioids (fentanyls and nitazenes) and (classic) hallucinogens in whole blood. Methods: The present work describes a method that allows the screening, qualitative confirmation, and quantification of more than 10 psychoactive substances, including new synthetic opioids and hallucinogens. The sample preparation step consisted in 50 µL of whole blood protein precipitation with refrigerated acetonitrile containing formic acid and was optimized using a design of experiments (DoE) approach, namely Full Factorial Design, to achieve the best conditions for compounds extraction from matrix. Following centrifugation, the resulting supernatant extract can be directly injected into an ultra-high-performance liquid chromatograph coupled to a triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer (Sciex UHPLC-QTRAP-MS® 6500+) and analyzed in a 5-minute run in Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode with 2 transitions for each compound. The developed analytical methodology was fully validated according to the guiding principles of the ANSI/ASB Standard 036. To confirm its applicability in a real context, the proposed methodology was applied to the analysis of authentic forensic samples. Results & Discussion: In terms of validation, the methodology linearity was assessed between 1 and 20 ng/mL. The precision and accuracy were satisfactory, with values <15% and within ±15% (20% at the LOQ), respectively. The limits of detection were between 0.1 and 1 ng/mL, depending on the compound. Dilution ratios were also successfully evaluated. Selectivity was confirmed by analyzing spiked samples containing several therapeutic drugs and other drugs of abuse. Conclusion: The proposed methodology provides a valuable and powerful tool for toxicology laboratory, enabling the simultaneous identification, confirmation, and quantification of different families of psychoactive substances, including synthetic opioids and hallucinogens. Its speed, simplicity, effectiveness, and reliability make it particularly advantageous for routine analysis. These combined advantages make it a suitable alternative for routine implementation.
- Bílis como matriz alternativa ou complementar na análise de drogas de abuso e benzodiazepinas por imunoensaios. Estudo preliminar.Publication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Mustra, Carla; Margalho, Cláudia; Frias, Eugénia; Fonte Santa, Jerónimo; Mendes, Luis; Mendonça, Ricardo; Franco, João MiguelA bílis é um fluído corporal que contribui para a purificação do fígado, sendo uma das vias de eliminação de xenobióticos e metabolitos que, uma vez presentes na bílis, são excretados nas fezes. Na ausência ou insuficiência da amostra de sangue, em situação post-mortem, a bílis pode ser colhida através da punção direta na vesícula biliar e consequente aspiração. Esta matriz é considerada uma amostra alternativa valiosa, na medida em que pode apresentar valores elevados das substâncias presentes. Objetivo: Verificar a viabilidade do uso de amostras de bílis nas análises de triagem de drogas de abuso e de benzodiazepinas por imunoensaios enzimáticos. Materiais e Métodos: A análise das amostras de bílis foi efetuada num equipamento semi-automático, EVOLIS Twin Plus System, seguindo os mesmos procedimentos do Serviço de Química e Toxicologia Forenses para as amostras de sangue. Foram usados os testes para análise de opiáceos, metabolitos da cocaína, canabinóides, anfetaminas, metanfetaminas e benzodiazepinas da OraSure Technologies, Inc. As amostras de bílis (200μl) foram diluídas com diluente forense numa proporção de 1:4. Paralelamente, nos casos possíveis, foi também analisada a amostra de sangue. Na avaliação dos resultados qualitativos sobre a presença ou ausência das substâncias a pesquisar foram usados os valores de cut-off em vigor para as amostras de sangue. Posteriormente, realizou-se a confirmação por métodos mais sensíveis e precisos, como a cromatografia de gases associada à espetrometria de massa (GC-MS) e a cromatografia líquida associada à espetrometria de massa (LC-MS-MS). Foram analisados 37 casos, 28 dos quais usámos as amostras de sangue e bílis e 9 só com amostra de bílis, por ausência de sangue. Resultados e Conclusão: Obtiveram-se resultados positivos e negativos nas amostras de bílis para drogas de abuso e benzodiazepinas, viabilizando a utilização da técnica de imunoensaios com os procedimentos do sangue. Os resultados negativos obtidos na bílis nos imunoensaios e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS permitem-nos concluir não haver casos de falsos negativos. Relativamente aos resultados positivos obtidos e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS, obtivemos confirmações positivas e negativas, concluindo-se uma possível existência de interferentes com reatividade cruzada nos imunoensaios. Concluindo, é possível a utilização da amostra de bílis para triagem de drogas de abuso e de benzodiazepinas por imunoensaios; que os resultados negativos poderão ser considerados como válidos por esta técnica e que os resultados positivos nem sempre são confirmados positivos por técnicas mais específicas. A amostra de bílis é, contudo, uma boa alternativa pois o número de resultados negativos é significativo em relação aos positivos e a sua análise por imunoensaios contribui para uma resposta mais rápida e menos onerosa para os nossos clientes, com confirmação apenas dos grupos com resultados positivos.
- Estudo de estabilidade de controlo analítico em método multi-substâncias por LC/MS-MS do SQTF.Publication . Mustra, Carla; Fonseca, Suzana; Monsanto, Paula; Franco, João MiguelINTRODUÇÃO/OBJETIVOS O desenvolvimento e validação de métodos analíticos é uma tarefa fundamental e frequente do Serviço de Química e Toxicologia Forenses (SQTF) que envolve o estudo de vários parâmetros como modelo de calibração, seletividade, sensibilidade, exatidão, precisão, estabilidade, entre outros. O grau de complexidade de uma validação aumenta a par com o número de substâncias abrangidas pelo método, bem como com a especificidade de cada substância. Tão ou mais importante que a validação do método é o seu controlo analítico ao longo do tempo, o que designamos por controlo de qualidade interno, o qual permite avaliar o desempenho do método e do equipamento. O SQTF tem vindo a ampliar o leque de substâncias pesquisadas nos seus laboratórios e a melhorar os níveis de sensibilidade dos métodos, com vista a dar resposta às solicitações. Este crescimento e melhoria dos métodos só foi possível devido à aquisição de novos equipamentos, o que implicou desafios acrescidos relativamente a vários aspetos, em particular quanto à metodologia usada para assegurar um controlo de qualidade interno eficaz. O objetivo deste trabalho é demonstrar como um estudo preliminar da estabilidade de um controlo analítico pode contribuir para a adoção de critérios que permitam avaliar o desempenho do método/equipamento ou mesmo conduzir a novas propostas, como por exemplo a escolha de padrões internos. MATERIAL E MÉTODOS Durante 2 meses foi injetado juntamente com as sequências analíticas de confirmação/quantificação de substâncias medicamentosas de amostras de rotina, um controlo analítico preparado a partir de uma amostra branca (sangue onde previamente se confirmou a ausência das substâncias em estudo) fortificada com cerca de 180 substâncias a uma concentração de 50 ng/mL. Foram avaliadas 177 substâncias medicamentosas relativamente à sua resposta ao longo do tempo (razão entre a área do analito e área de padrão interno: clomipramina d3) num total de 13 injeções. O tratamento estatístico dos dados foi efetuado com recurso à aplicação Microsoft Office Excel®. RESULTADOS E DISCUSSÃO Verificou-se que a maioria das substâncias, cerca de 80%, apresentaram um comportamento estável ao longo do período estudado. Identificaram-se, no entanto, algumas substâncias com variações assinaláveis ao longo do tempo, nomeadamente algumas estatinas e benzodiazepinas cujo coeficiente de variação da razão das áreas é superior a 60%. Nestes casos será importante avaliar as causas destas variações cuja correção poderá, eventualmente, ser implementada através da seleção de um padrão interno mais específico. CONCLUSÕES O estudo de estabilidade de um controlo analítico revelou-se uma ferramenta importante para definir critérios de monitorização do desempenho do método e do próprio equipamento. A maioria das substâncias parece ter estabilidade nas condições testadas, no entanto identificaram-se alguns analitos menos estáveis para os quais será adequado selecionar marcadores de estabilidade ou redefinir padrões internos que sejam mais específicos.
- Determinação de rivastigmina, inibidor seletivo da colinesterase cerebral, em amostras de sangue. Aplicação a casos forenses.Publication . Proença, Paula; Castanheira, Alice; Mustra, Carla; Castanheira, Fernando; Franco, João Miguel; Corte Real Gonçalves, FranciscoIntodução: Sempre que ocorre uma situação relevante de pesquisa de um fármaco não incluído no leque de substâncias detetadas, o laboratório dedica-se a implementar a sua técnica de modo a poder ser dada uma resposta à perícia solicitada. A rivastigmina é um inibidor das colinesterases do tipo carbamato, utilizada no tratamento de demência associada à doença de Alzheimer e à doença de Parkinson. Material e Métodos: No procedimento analítico de determinação de rivastigmina, as amostras biológicas foram previamente extraídas por precipitação proteica, utilizando 0,1 mL de amostra, e posteriormente analisadas por LC-MS/MS. A separação cromatográfica foi efetuada com uma coluna de fase reversa e uma fase móvel, em gradiente, constituída por formato de amónia aquoso 2mM e por metanol, a um fluxo de 0,4 mL/min. Na análise por MS/MS foi utilizado um triplo quadrupolo com ionização por electrospray (ESI). A aquisição de dados por monitorização de reações múltiplas (MRM) foi utilizada na deteção e quantificação de rivastigmina (RT= 4,22), de acordo com as seguintes transições: m/z 251,2>206,1 e m/z 251,2>86,2, em modo ESI positivo. Resultados e Discussão: Na validação da técnica analítica apresentada foram avaliados os parâmetros incluídos no procedimento interno de validação de métodos qualitativos e quantitativos em vigor no laboratório de toxicologia forense. Para a quantificação de rivastigmina foi utilizada uma curva de calibração com concentrações compreendidas entre 5 a 100 ng/mL e controlos ajustados a essa gama de trabalho. Foi ainda avaliada a precisão a dois níveis, a 10 e a 50 ng/mL, a precisão intermédia e o limite de repetibilidade (<20%). Quanto à exatidão, a rivastigmina apresenta recuperações médias estatisticamente semelhantes a 100%, comprovando a inexistência de erro sistemático. O método foi aplicado a 8 casos forenses com concentrações sanguíneas de rivastigmina entre 8,1 a 78 ng/mL. Os resultados obtidos da análise de rivastigmina por procedimentos de triagem, de confirmação e de quantificação foram avaliados. Conclusões: O método validado demonstrou ser seletivo, específico, exato, preciso, robusto e linear na gama de trabalho, cumprindo todos os critérios de aceitação exigidos na determinação deste tipo de substâncias em amostras biológicas analisadas no âmbito da toxicologia forense.
- Importância forense dos fármacos que atuam no aparelho cardiovascular. O top 5 dos fármacos mais detetados no SQTF-C em 2023Publication . Mustra, Carla; Proença, Paula; Castanheira, Alice; Castanheira, Fernando; Monsanto, Paula; Franco, João MiguelINTRODUÇÃO: A pesquisa de medicamentos, drogas e álcool constituem a maioria das perícias realizadas no Serviço de Química e Toxicologia Forenses (SQTF). O desenvolvimento de novos métodos de análise ou melhoria da capacidade de deteção de substâncias novas ou já existentes é uma constante neste serviço, pelo que a avaliação estatística dos resultados e a atualização da informação relativamente a novas tendências de mercado (medicamentos e drogas) deve ser realizada com alguma frequência. Atualmente o SQTF pesquisa de forma sistemática mais de 200 substâncias quando é solicitada a análise de medicamentos. Destas, 65% atuam sobre o sistema nervoso central, 20% atuam sobre o aparelho cardiovascular e as restantes 15% pertencem a outros grupos farmacológicos de acordo com a classificação do índice terapêutico. OBJETIVOS: Este trabalho tem como objetivo apresentar quais os fármacos mais detetados no SQTF na delegação do Centro (SQTF-C) no ano de 2023 e indicar os grupos farmacológicos com maior prevalência. Pretende-se estabelecer um paralelismo com a informação recolhida junto do INFARMED relativamente aos medicamentos prescritos e comparticipados, dispensados nas farmácias comunitárias, em Portugal Continental. Este tipo de estudo é um dos mecanismos que permite ao SQTF definir prioridades na pesquisa de substâncias. RESULTADOS/DISCUSSÃO: No ano de 2023 foram solicitadas 1922 análises de medicamentos ao SQTF-C. Em 70% dos casos foram detetadas substâncias medicamentosas. No leque de substâncias pesquisadas de forma sistemática detetaram-se 147 substâncias diferentes, sendo a mais prevalente o Paracetamol, encontrado em 27% dos casos, seguido pela Furosemida (15%), pela Amlodipina (14%) e pelo Bisoprolol (12%), os três últimos pertencentes ao grupo de fármacos que atuam sobre o aparelho cardiovascular. Em quinto lugar, com uma prevalência de 11% surge o Nordiazepam, metabolito de diversas benzodiazepinas como o Diazepam, Clorodiazepóxido, Clorazepato dipotássico, o Cetazolam e o Prazepam. CONCLUSÕES: Os fármacos do Grupo 3. Aparelho cardiovascular, mais concretamente os anti-hipertensores Furosemida (diurético da ansa), Amlodipina (bloqueadores da entrada de cálcio) e Bisoprolol (bloqueador beta) são os mais detetados no SQTF-C logo depois do Paracetamol. No Top 5 das substâncias detetadas inclui-se ainda o Nordiazepam. Estes resultados estão em linha com os dados disponibilizados pelo INFARMED e são expectáveis tendo em conta a prevalência das doenças cardiovasculares que afetam grande parte da população portuguesa.