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- Exposição prolongada a cocaína documentada através da análise por segmento de amostras de cabelo de uma criançaPublication . Barroso, Mário; Margalho, Cláudia; Franco, João Miguel
- Solid Phase-Based Microextraction Techniques in Therapeutic Drug MonitoringPublication . Soares, Sofia; Rosado, Tiago; Barroso, Mário; Gallardo, EugeniaTherapeutic drug monitoring is an established practice for a small group of drugs, particularly those presenting narrow therapeutic windows, for which there is a direct relationship between concentration and pharmacological effects at the site of action. Drug concentrations in biological fluids are used, in addition to other clinical observation measures, to assess the patient’s status, since they are the support for therapy individualization and allow assessing adherence to therapy. Monitoring these drug classes is of great importance, as it minimizes the risk of medical interactions, as well as toxic effects. In addition, the quantification of these drugs through routine toxicological tests and the development of new monitoring methodologies are extremely relevant for public health and for the well-being of the patient, and it has implications in clinical and forensic situations. In this sense, the use of new extraction procedures that employ smaller volumes of sample and organic solvents, therefore considered miniaturized and green techniques, is of great interest in this field. From these, the use of fabric-phase extractions seems appealing. Noteworthy is the fact that SPME, which was the first of these miniaturized approaches to be used in the early ‘90s, is still the most used solventless procedure, providing solid and sound results. The main goal of this paper is to perform a critical review of sample preparation techniques based on solid-phase microextraction for drug detection in therapeutic monitoring situations.
- Analysis of Cannabinoids in Biological Specimens: An UpdatePublication . Antunes, Mónica; Barroso, Mário; Gallardo, EugeniaCannabinoids are still the most consumed drugs of abuse worldwide. Despite being considered less harmful to human health, particularly if compared with opiates or cocaine, cannabis consumption has important medico-legal and public health consequences. For this reason, the development and optimization of sensitive analytical methods that allow the determination of these compounds in different biological specimens is important, involving relevant efforts from laboratories. This paper will discuss cannabis consumption; toxicokinetics, the most detected compounds in biological samples; and characteristics of the latter. In addition, a comprehensive review of extraction methods and analytical tools available for cannabinoid detection in selected biological specimens will be reviewed. Important issues such as pitfalls and cut-off values will be considered.
- Determination of Ketamine and Norketamine in hair samples using MEPS as sample clean-upPublication . Simão, Ana Y.; Oliveira, Patrik; Rosendo, Luana M.; Rosado, Tiago; Gallardo, Eugenia; Andraus, Maristela; Barroso, MárioIntroduction and Aim: The use of hair samples to determine ketamine (K) and its metabolite, norketamine (NK), has been studied by several authors, using different clean-up approaches. However, microextraction by packed sorbent (MEPS), a miniaturized form of the classic solid-phase extraction has not been applied to date for the purpose. Therefore, a method to determine K and NK in hair samples was developed, optimized, and validated using MEPS as sample clean-up. Materials & Methods: Hair samples were scissor-cut into small fragments, and rinsed with methanol to remove dirt and externally deposited material. Following an overnight incubation with methanol at 65 ºC (no stirring), the compounds were analysed by GC-MS/MS without the need of derivatization procedures; MEPS conditions were: conditioning (5 x 250 µL of methanol and 4 x 250 µL of deionized water); load (10 x 150 µL of hair extract); washing (50 µL of 0.1% acetic acid and 50 µL of 10% methanol); and elution (100 µL of 3% ammonium hydroxide in methanol). Results & Discussion: The procedure resulted in acceptable recoveries, 39-61% for K and 32-43% for NK, and allowed reaching limits of quantification (LOQs) of 50 pg/mg for both analytes. The analytical method presented acceptable accuracy and precision with coefficients of variation typically lower than 15% and BIAS within ± 15%, except at the LOQ (20%). The method was successfully applied to 2 authentic samples, and ketamine concentrations were below 0.05 and 0.18 ng/mg. Norketamine was not detected. Conclusions: This work is the first analytical method using MEPS coupled to GC-MS/MS for the determination of K and NK in hair samples. Following a comparison with a SPE-based method using authentic samples, it was considered rapid and suitable for routine analysis. Acknowledgments: FCT (UIDB /00709/2020 and UIDP/00709/2020). A.Y. Simão acknowledges the PhD fellowship from FCT (2020.09070.BD).
- Análise toxicológica forense a amostras não biológicas e cabelo: investigando a possível relação com um cadáver mumificadoPublication . Margalho, Cláudia; Barroso, Mário; Franco, JoãoA análise toxicológica forense é uma ferramenta fundamental no auxilio da investigação de casos complexos através da identificação de substâncias tóxicas presentes nas amostras relacionadas com essas investigações. Um cenário peculiar que pode requerer essa abordagem especializada é a investigação de um cadáver mumificado. A mumificação é um processo natural ou artificial que preserva o corpo de um cadáver, por um longo período de tempo, muitas vezes ocorrendo em condições que dificultam a decomposição. Neste contexto, este estudo propõe explorar a aplicação da análise toxicológica forense a amostras não biológicas e cabelo, com o objetivo específico de investigar a possível relação entre essas amostras e um cadáver mumificado. Tal investigação é desafiadora, considerando a natureza das amostras e o seu estado de conservação, bem como a necessidade de aplicar metodologias analíticas sensíveis e adaptadas que conduzam à obtenção de resultados fiáveis. Com a crescente necessidade de utilizar métodos interdisciplinares para esclarecer casos desconhecidos, a aplicação da análise toxicológica forense a amostras não biológicas e cabelo apresenta-se como uma abordagem promissora. Ao ampliar o nosso conhecimento sobre a história e circunstâncias que envolvem o cadáver mumificado, podemos contribuir para uma melhor compreensão sobre o passado dessa pessoa assim como para a causa que levou à sua morte. Os autores apresentam um caso de restos humanos decompostos (não identificados) encontrados numa casa devoluta, situados junto a um conjunto de objetos: cachimbo artesanal, bocal, cigarros e seringas. Houve informações de que a vítima seria toxicodependente mas a causa da sua morte foi desconhecida. As amostras não biológicas e o cabelo foram analisadas por GC-MS após extração e limpeza apropriadas. Foram detetadas as seguintes substâncias: seringa A – cocaína, heroína, fenacetina, paracetamol; seringa B - cocaína, fenacetina, cafeína, nicotina, noscapina; bocal – cocaína; cachimbo artesanal – cocaína; fenacetina e paracetamol; cigarro A – nicotina e cotinina; cigarro B – nicotina, cotinina, fenacetina, cafeína. Estes resultados orientaram as análises de Congresso Nacional cabelo para a pesquisa de opiáceos e cocaína. O cabelo foi positivo para cocaína (57 ng/mg), benzoilecgonina (17 ng/mg), norcocaína (2,20 ng/mg), cocaetileno (não quantificado), 6-acetilmorfina (4,65 ng/mg), morfina (4,52 ng/mg), codeína (0,83 ng/mg) e tramadol (0,87 ng/mg). Os achados no cabelo são compatíveis com os da parafernália, o que é muito sugestivo de que, os objetos pertenciam ao cadáver mumificado.
- Microextraction by packed sorbent clean-up for the determination of selected synthetic cathinones in hair samplesPublication . Simão, A.; Margalho, Cláudia; Dinis, P.; Andraus, M.; Barroso, Mário; Gallardo, E.Background and aims: The use of synthetic cathinones (SC), also known as "bath salts," has been increasing in recent years, leading to a growing concern about their effects on public health. Different clean-up approaches have already been studied by different authors. However, microextraction by packed sorbent (MEPS), a miniaturized form of solid-phase extraction, has not been explored extensively for the determination of SC in hair samples. Therefore, we propose the optimization of the MEPS procedure as sample clean-up method followed by gas chromatography mass spectrometry for the determination of these analytes in hair samples. Methods: Hair samples were washed consecutively with dichloromethane, deionized water and methanol to remove dirt and externally deposited material. After drying, hair was scissor-cut into small fragments. Fifty milligrams of hair were incubated overnight in the presence of 1 M NaOH at 45 °C, after which the extracts were neutralized and subjected to MEPS using a C8-SCX cartridge. The compounds were analyzed underivatized by GC-MS in the SIM mode. MEPS conditions were conditioning (250 μL of methanol followed by 250 μL of water), sample loading (24 x 700 μL of hair extract) and elution (7 x 100 μL of 2% NH4OH in acetonitrile). Results and discussion: The procedure resulted in acceptable recoveries (15-59% for all analytes), and allowed reaching lower limits of quantification (LLOQs) of 100 pg/mg for 4-MDMB, 4-MNEB and 4- MDMP and of 200 pg/mg for the remaining analytes (4-CEC, 4-MNEP, 4-MDEB, 4-MDMH, ethylone, alpha-PVP, penthylone, 4-Cl-PVP, MPHP and MDPV). Conclusions: In this work the optimization of the MEPS technique coupled to GC-MS for the determination of selected synthetic cathinones in hair samples is presented. The method was considered suitable for the analysis of these compounds in hair, providing acceptable recoveries and obtaining low limits of quantification.
- Development and validation of a multi-substance method for routine analysis of pesticides in post-mortem samples by UPLC-MS/MSPublication . Matos, Francisco; Barroso, Mário; Antunes, Mónica; Franco, João; Fonseca, SuzanaPesticides play an important role in forensic toxicology and are usually classified as a single class of chemicals, but in fact there are several different types of compounds, including organophosphates, carbamates, pyrethroids or organochlorines, among others, with different toxicities. Pesticide analysis in post-mortem samples can be difficult due to the complexity of the samples and to the high toxicity of these compounds. The aim of this study was to develop and validate an easy to use, sensitive, and robust method, using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry to be incorporated in the routine flow for more than fifty pesticide analysis in post-mortem blood. The developed analytical method was fully validated according to the guiding principles of the ANSI/ASB Standard 036 and applied to routine post-mortem samples, being already detected more than 15 positive cases. This UPLC-MS/MS method is useful and a powerful tool in a toxicology lab because it is fast, simple, effective, and trustworthy. This method is able to detect and analyse pesticides in post-mortem samples. It is set to use for routine analysis and successfully applied to intoxication cases.
- Desenvolvimento e validação de um método analítico para a determinação de canabinóides em amostras de fluido oral por LC-MS/MSPublication . Antunes, Mónica; Simões, Susana; Fonseca, Suzana; Franco, João; Gallardo, Eugenia; Barroso, MárioA canábis é a droga de abuso mais consumida na Europa, pelo que várias metodologias analíticas têm sido desenvolvidas para a quantificação dos seus componentes em matrizes biológicas, especialmente sangue e urina. No entanto, cada vez mais se está a reconhecer a importância do estudo de matrizes biológicas não-convencionais, nomeadamente cabelo e fluido oral (ou saliva) – os seus procedimentos de recolha não são invasivos e estas amostras fornecem informações complementares sobre o uso de drogas, permitindo o controlo da exposição recente (saliva) e de médio a longo prazo (cabelo). Desta forma, foi desenvolvida uma metodologia analítica para a determinação e quantificação de tetrahidrocanabinol (THC), 11-hidroxi-tetrahidrocanabinol (THC-OH), 11-carboxitetrahidrocanabinol (THC-COOH), canabinol (CBN) e canabidiol (CBD) em amostras de saliva por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Segundo as Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs, o cut-off de THC em amostras de saliva é 2 ng/mL, exigindo um procedimento de extração otimizado e a utilização de uma técnica cromatográfica sensível. Resumidamente, a 200 μL de saliva foi adicionado o padrão interno, e as amostras foram submetidas a precipitação proteica com uma mistura de metanol/acetonitrilo (80:20, v/v) refrigerada. Depois de centrifugados, os extratos foram evaporados até à secura, reconstituídos em metanol, e 5 μL foram injetados no equipamento UPLC-QTRAP-MS 6500+ (SCIEX®), numa corrida de 14 minutos. A análise foi efetuada em modo MRM com duas transições para cada composto e uma transição para cada padrão interno. Os métodos foram validados de acordo com as diretrizes da norma ANSI/ASB 036, tendo sido estudados os parâmetros supressão iónica, interferentes, linearidade, precisão e exatidão, carryover, limites de deteção e quantificação, efeito de diluição e estabilidade das amostras extraídas. Todos os estudos destes parâmetros apresentaram resultados satisfatórios, e o método foi aplicado com sucesso a amostras reais. O método desenvolvido mostrou-se fácil, rápido, eficaz e robusto, estando apto para ser utilizado na rotina do laboratório, e sendo uma ferramenta complementar útil para o estudo do consumo recente de canabinóides.
- Documenting human exposure to cannabinoids using oral fluidPublication . Antunes, Mónica; Simões, Susana; Fonseca, Suzana; Franco, João Miguel; Gallardo, Eugenia; Barroso, MárioThe importance of studying non-conventional biological matrices such as oral fluid (OF) is increasingly being recognized. This sample presents several advantages, mainly related to its collection procedure: it is non-invasive, easy to perform by non-medical personnel, can be performed under supervision to prevent adulteration, and provides low biohazard risk. OF samples are more likely to contain parent drugs, reflecting recent drug use – a major advantage of this matrix1. A fast and robust analytical methodology was developed in OF samples for the determination of tetrahydrocannabinol (THC), 11-hydroxy-tetrahydrocannabinol (THC-OH), 11-carboxytetrahydrocannabinol (THC-COOH), cannabinol (CBN) and cannabidiol (CBD) by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), aiming at documenting cannabis consumption. Briefly, 200-μL aliquots of OF were subjected to protein precipitation with a refrigerated methanol/acetonitrile mixture (80:20, v/v). After centrifugation, the extracts were evaporated to dryness, reconstituted in methanol, and 5-μL aliquots were injected into the UPLC-QTRAP-MS 6500+ (SCIEX®) system (in a 14-minute run). The analysis was carried out in MRM mode with two transitions for each compound and one transition for each internal standard. The method was validated according to the guidelines of ANSI/ASB 0362. Parameters such as ion suppression/enhancement, interferents, linearity, precision and accuracy, limits of detection and quantification, dilution integrity and stability were studied and showcased satisfactory results. The 2 ng/mL cut-off for THC3 was achieved, and the method was successfully applied to real samples (57.95- 898.28 ng/mL for THC; 0.17-4.09 ng/mL for THC-COOH; 1.26-44.57 ng/mL for CBN; 0.42-1007.86 ng/mL).
- Validação de um método analítico para a determinação de antidepressivos em fluido oral com recurso a MEPS e análise por GC-MS/MSPublication . Soares, Sofia; Rosado, Tiago; Barroso, Mário; Gallardo, EugeniaO consumo de antidepressivos representa uma problemática a nível mundial, apresentando Portugal uma das taxas de prevalência de doenças mentais mais elevadas da Europa. A monitorização terapêutica é uma prática instituída para um pequeno número de fármacos para os quais há uma relação direta entre a concentração e o efeito farmacológico, envolvendo habitualmente a determinação de drogas no soro, plasma ou sangue. O presente trabalho descreve uma metodologia para a determinação de antidepressivos (fluoxetina, venlafaxina, sertralina, citalopram, paroxetina e metabolitos) em fluido oral (250 μL) com recurso à microextração em seringa empacotada (MEPS) e à cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa em tandem (GC-MS/MS). A técnica MEPS foi otimizada utilizando a ferramenta estatística Design of Experiments (DoE). Previamente à MEPS procedeu-se à precipitação proteica do fluido oral com 500 μL de acetonitrilo gelado, após a qual se centrifugou, decantou e se evaporou o sobrenadante. Posteriormente, dissolveu-se o resíduo em 1 mL de tampão fosfato 25 mM (pH 6). A técnica de MEPS otimizada consistiu no acondicionamento com 250 μL de metanol (MeOH) e 250 μL de 0,1% HCOOH em H2O; load de 150 μL da amostra (12×); lavagem com 4x50 μL de HCOOH a 1% em H2O; secagem por aspiração de 4x50 μL de ar; eluição com 4x100 μL 1% NH4OH em MeOH. O eluato foi evaporado e procedeu-se à derivatização por 2 min em microondas a 800 W, após o qual se injetaram 2 μL no sistema cromatográfico. O método foi validado de acordo com as diretrizes internacionalmente aceites da Food and Drug Administration para o intervalo de linearidade entre 10 e 500 ng/mL. Obtiveram-se valores de coeficiente de determinação de pelo menos 0,99 e os valores de erro relativo e coeficiente de variação foram definidos de acordo com os critérios de validação. Os limites de quantificação foram estabelecidos entre os 10 e os 100 ng/mL e as recuperações absolutas variaram entre 12 e 93%. A estabilidade foi estudada para amostras processadas, estabilidade de bancada e ciclos de congelação/descongelação e a metodologia foi aplicada na análise de amostras autênticas de fluido oral. De salientar que este é o primeiro trabalho que utiliza MEPS para determinação de antidepressivos e metabolitos em amostras de fluido oral.