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- Desenvolvimento e validação de uma metodologia por GC-MS-ECD para a determinação de inseticidas organofosforados em sangue totalPublication . Valente, Nuno I.P.; Tarelho, Sónia; Castro, André Lobo; Silvestre, Armando; Teixeira, HelenaIntrodução: Os pesticidas são substâncias destinadas a prevenir, destruir ou controlar pragas. No entanto, estes produtos são também responsáveis por intoxicações em seres humanos. Em Portugal, mais de metade das intoxicações voluntárias em humanos com pesticidas envolvem inseticidas organofosforados (IOFs). Neste trabalho, pretendeu-se desenvolver e validar um conjunto de metodologias para a determinação analítica de dez IOFs, nomeadamente, clorfenvinfos, clorpirifos, diazinão, dimetoato, fentião, fosalona, malatião, paratião, pirimifos-metilo e quinalfos, em amostras de sangue total e de conteúdo gástrico, tendo em vista a introdução das mesmas na rotina pericial do Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, Instituto Público (STF-N). Material and Métodos: Foram testados dois procedimentos de extração em fase sólida com colunas Oasis® HLB 3cc (da Waters) e um com colunas Sep-Pak® C18 3cc (também da Waters). Foi utilizada como técnica de separação um cromatógrafo de gás Agilent 6890N, acoplado a um espetrómetro de massa Agilent 5973N com um quadrupolo, e a um detetor de captura eletrónica Agilent G2397A. Resultados e Discussão: O método de extração com colunas Sep-Pak® C18 foi selecionado uma vez que no final do processo de extração e análise foram gerados sinais cinco vezes superiores aos obtidos após extração com as outras colunas de SPE, e mostrou ser seletivo para isolamento dos analitos e do padrão interno (etião) em amostras de sangue postmortem. Foram preparadas curvas de calibração entre 50 e 5000 ng/mL, utilizando modelos de regressão linear ponderada. Devido à sensibilidade mais baixa do detetor, não foi possível definir uma gama de trabalho para o fentião por GC-ECD, enquanto para o pirimifos-metilo esta foi estabelecida entre 500 e 5000 ng/mL. O limite de quantificação foi definido a 50 ng/mL para todos os analitos, à exceção do pirimifos-metilo por GC-ECD (500 ng/mL). A eficiência de extração média situou-se entre os 72 e os 102%. O método mostrou ser robusto e adequado ao propósito, tendo sido já aplicado na rotina do laboratório. Conclusão: Apesar de várias vezes descrita a utilização de GC-MS, não foi encontrada na literatura qualquer referência a trabalhos com GC-ECD em amostras biológicas humanas e, por isso, esta será a primeira descrição da utilização de um detetor de captura eletrónica acoplado a um cromatógrafo gasoso na análise deste tipo de amostras. A utilização de duas colunas de separação cromatográfica e dois detetores, GC-ECD e GC-MS, permitiu a realização da análise de rastreio por GC-ECD e de confirmação qualitativa por GC-ECD assegurando deste modo a existência de metodologias diferentes necessárias para a emissão de um resultado positivo. A quantificação é realizada por GC-MS. A utilização de dois sistemas cromatográficos num mesmo equipamento permite também a economia de recursos e espaço no laboratório, e disponibilidade do operador. A validação da metodologia com base na NP EN ISO/IEC 17025:2005 por via de um processo integrado e contínuo assegura a adequabilidade dos método e a qualidade dos resultados.
- Desenvolvimento e validação de um método de rastreio para Ketamina (KET) por imunoensaios enzimáticosPublication . Coelho, Francisco; Costa, Pedro; Melo, Paula; Quintas, Maria José; Tarelho, Sónia; Castro, André Lobo; Teixeira, HelenaIntrodução: Nas últimas décadas, têm sido frequentemente reportados casos em que drogas legais são utilizadas de forma ilícita/descontextualizada, sendo a ketamina um exemplo. A ketamina foi inicialmente desenvolvida como anestésico. No entanto, cedo passou a ser também classificada como “club drug”, tendo um caráter alucinogéneo e funcionando como anestésico dissociativo, dados os distúrbios psiquiátricos de tal ordem graves que causava e causa nos pacientes/consumidores. O objetivo principal deste trabalho foi o desenvolvimento e validação de um método de deteção da ketamina por imunoensaios enzimáticos (método de rastreio) em amostras de sangue total e de urina, in vivo e post-mortem, de forma a que seja posteriormente aplicável na rotina deste serviço. Materiais e Métodos: Os imunoensaios foram realizados num equipamento Bio-Rad CODA® Automated EIA Analyzer. O kit utilizado foi o Ketamine Micro-Plate EIA – Forensic Application da OraSure Technologies, Inc.. Para os passos da validação, amostras brancas de sangue total e de urina foram fortificadas com diferentes concentrações de KET (210, 300, 510, 3000 ng/mL). Para a avaliação da ocorrência de reatividade cruzada, diferentes amostras foram fortificadas com fenciclidina (10, 100 ng/mL). Resultados e Discussão: Para validar a técnica analítica, foram avaliados os seguintes parâmetros: especificidade e seletividade do método (utilizando soluções de ketamina e de fenciclidina, que é um análogo estrutural da primeira), até à comprovação da não ocorrência de arrastamento, passando pela garantia da robustez do método perante a introdução de diversas variáveis. Da realização de todos os testes propostos, surgiu a evidência do desempenho adequado de diversos parâmetros essenciais: o método revelou-se específico/seletivo para a ketamina, foi verificada a ausência de reatividade cruzada com outros compostos (mesmo que estruturalmente semelhantes à KET), não se verificou arrastamento de analito e a robustez do método foi também assegurada através do estudo de diversas variáveis distintas propositadamente introduzidas. Os resultados obtidos na validação permitem concluir que o método se revelou adequado e eficiente para a deteção de ketamina nas amostras testadas (sangue branco, mistura de sangues reais e urina), com um cut-off de 210 ng/mL, quer para sangue, quer para urina, permitindo a sua aplicação na rotina do Serviço de Toxicologia Forense.
- Determinação de GHB em Amostras BiológicasPublication . Castro, André Lobo; Reis, Flávio; Teixeira, HelenaApresentação dos parâmetros de Validação Analítica já estudados no desenvolvimento da técnica de determinação de GHB em amostras biológicas (sangue, urina, cabelo). Serão apresentados os estudos preliminares realizados para o desenvolvimento do método analítico e os resultados de validação obtidos até ao momento no estudo e desenvolvimento da técnica analítica, designadamente, extracção em fase sólida (SPE) e Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa em tandem (GC/MS-MS).
- GHB Detection in biological samples by GC‐MS‐MS with forensic purposesPublication . Castro, André Lobo; Reis, Flávio; Teixeira, HelenaApresentação dos parâmetros de Validação Analítica já estudados no desenvolvimento da técnica de determinação de GHB em amostras biológicas (sangue, urina, cabelo). Serão apresentados os resultados de validação obtidos até ao momento no estudo e desenvolvimento da técnica analítica para amostras de sangue, designadamente, extração em fase sólida (SPE) e Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa em tandem (GC/MS-MS). Serão também apresentados os resultados dos testes de extração efetuados para efeitos de desenvolvimento da técnica analítica para amostras de cabelo, designadamente, extração líquido-líquido e Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa em tandem (GC/MS-MS).
- GHB – amostragem e armazenamento de amostras biológicas de interesse com fins forensesPublication . Castro, André Lobo; Dias, Mário; Reis, Flávio; Teixeira, HelenaO Ácido gama-hidroxibutírico (GHB) é um composto endógeno com um historial de utilização clínica desde os anos 1960’s. No entanto, devido aos seus efeitos secundários, foi classificado como uma substância controlada. É uma substância associada ao consumo ilícito para fins recreativos, para aumento forçado de massa muscular por parte de praticantes de culturismo e ainda ao abuso sexual facilitado por substâncias. A interpretação medico-legal de um resultado positivo para GHB está dependente do seu contexto endógeno e do comportamento post-mortem do composto. Neste pressuposto, serão discutidos os valores endógenos de GHB, quer in-vivo, quer post-mortem, e serão sugeridos alguns cuidados no que diz respeito à amostragem e armazenamento das diferentes amostras biológicas passíveis de ser utilizadas em contexto clínico e forense.
- 1,4-Butanediol intoxication: a case reportPublication . Castro, André Lobo; Tarelho, Sónia; Dias, Ana Sofia; Melo, Paula; Teixeira, Helena; Franco, João MiguelGamma-hidroxibutyric acid (GHB) is an endogenous compound with known action at the neural level. Its psychoactive effects led to an illicit use context including recreational purposes, muscle building effects in bodybuilders and drugs-facilitated crimes, specifically, in sexual assaults. Besides the use of the main compound, there are precursors, like Gammabutyrolactone (GBL) and 1,4-butanediol (1,4-BD), usually non controlled substances, allowing a much easier way to obtain the target-compound. The authors present the first reported intoxication case in Portugal with 1,4-Butanediol, including the quantification of GHB and GHB-GLUC in serum, by GC-MS/MS TQD. A male, 25 years old, entered in coma at the hospital emergency room, with the suspicion of an intoxication due to an unknown liquid ingestion. The forensic toxicology lab was asked to collaborate in order to identify the possible substance(s) involved and provide adequate treatment to the patient. The suspicious liquid and a serum sample were sent by the hospital and analysed by GC-MS-single quadrupole and GC-MS/MS TQD, respectively. A methodology including protein precipitation and GC-MS/MS TQD analysis was used to detect and quantify GHB and GHB-GLUC in serum. Toxicological analysis revealed the presence of 1,4-Butanediol in the liquid and GHB [171 mg/L] and GHB-GLUC [13,7 mg/L] in serum.The victim reverted the coma state with no neurological sequelae. This was the first detected case in Portugal with 1,4-Butanediol, suggesting that it is important to be aware that consumers have different options to acess illicit compounds, such as GHB. On the other hand, GHB-GLUC was identified and quantified for the first time in a real case sample, due to intoxication. This case highlights the importance of analyzing all samples for active compounds, percursors and metabolites that can lead to the main intoxication origin.
- MDMA Intoxication in potential donor with cardiac arrest – A case reportPublication . Castro, André Lobo; Tarelho, Sónia; Almeida, Dina; Sousa, Lara; Franco, João Miguel; Teixeira, HelenaAmphetamines consumption is still an important public health issue, namely in terms of compounds variability and disposition to consumers. However, some of them, still classic substances, keep standing in the illicit market, with remarkable and continuous success. That is the case of MDMA. Nevertheless, there is always new information and data on MDMA intoxication, both in vivo as in post-mortem context. The authors report an intoxication case with MDMA in an 18 years old male, who was considered a potential organ donor, after a cardiac arrest. Whole blood samples were collected in vivo, at the Emergency Room (ER), in different moments, and post-mortem, at the Forensic Pathology Service of the National Institute of Legal Medicine and Forensic Science. After a general screening procedure, samples were extracted by an SPE procedure (OASIS® MCX) followed by a GC-MS single quad analysis. The post-mortem whole blood sample was positive for Lidocaine (< 500 ng/mL), compatible with ER intervention, and positive for MDMA (2278 ng/mL) and MDA (49 ng/mL), while the whole blood samples collected in vivo (during the maintenance of the individual under advanced life support), were positive for MDMA (between 504 ng/mL and 1918 ng/mL) and MDA (between 20 ng/mL and 89 ng/mL). The samples were negative for other substances, namely ethanol, other drugs of abuse and medicines. Interpretation of these results is pivotal to understand the behaviour of the substance. So, in this case, MDMA post-mortem behaviour should be carefully evaluated, considering as possible influencers, in the specific context of the case, the time lapse between the death verification, the maintenance of the advanced life support and the body manipulation for organ collection purposes. Also referred and discussed is the ante-mortem/post-mortem ratio of MDMA obtained values, compared with literature references. No doubt that death was due to MDMA intoxication, but information from the in vivo samples analysis suggests that this type of sample should also be considered, in a complementary role, whenever possible.
- Endogenous GHB concentrations in whole blood postmortem samples as a biomarker for post mortem interval estimation – A set of real cases analysisPublication . Castro, André Lobo; Tarelho, Sónia; Dias, Mário; Reis, Flávio; Teixeira, HelenaGamma-hydroxybutyric acid (GHB) is an endogenous compound which has a story of clinical use and illicit abuse since the 1960’s. Its postmortem behaviour, namely regarding degradation and metabolism, has been increasingly studied to be used as a putative biomarker for post-mortem interval (PMI) estimation. Thus, whole blood post-mortem GHB levels were obtained in thirty two real cases with previous information on death and autopsy data. The samples were treated through sample methanolic precipitation followed by GC-MS/MS analysis (LLOQ=0.1 mg/L). No differences were encountered for the other parameters evaluated, including age [under 44 years-old - 7.87 2.06 mg GHB/L (n=7), 45 to 60 years-old - 6.80 3.67 mg GHB/L (n=13) and over 61 years-old - 5.72 2.39 mg GHB/L (n=12), p0.05], gender [men - 7.79 5.04 mg GHB/L (n=23), women - 6.72 2.60 mg GHB/L (n=9), p=0.273], cause of death [accident - 7.96 ± 2.26 mg GHB/L (n=8), suicide - 6.75 ± 3.22 mg GHB/L (n=7) and unknown/natural death - 5.14 ± 2.96 mg GHB/L (n=17), p0.05] and presence or absence of substances [absence - 6.37 2.61 mg GHB/L, presence - 6.96 3.38 mg GHB/L, p=0.405]. On the other hand, the results obtained suggest that the PMI (until 5 days between death and sampling) influences GHB whole blood concentration, noticed namely between 48 and 72 hours (24 - 48 hours (p=0.893), 48 - 72 hours (p<0.05); 72 - 96 hours (p=0.123). This study brings additional data regarding the usefulness of GHB levels in forensic toxicology, which might be further strengthened with larger, but comparable, studies from other laboratories and institutions in the forensic toxicology context.
- Valores endógenos de GHB em amostras biológicas post-mortem – determinação analítica e avaliação estatísticaPublication . Castro, André Lobo; Tarelho, Sónia; Franco, João Miguel; Reis, Flávio; Teixeira, HelenaO Ácido gama-hidroxibutírico (GHB) é um composto endógeno com um historial de utilização clínica desde os anos 1960’s. No entanto, devido aos seus efeitos secundários, foi classificado como uma substância controlada. É uma substância associada ao consumo ilícito para fins recreativos, para induzir o aumento da massa muscular por parte de praticantes de culturismo e ainda ao abuso sexual facilitado por substâncias. No entanto, a interpretação médico-legal de um resultado positivo para GHB está dependente do seu contexto endógeno e do comportamento post-mortem do composto. Neste pressuposto, serão apresentados os valores de GHB determinados num conjunto de amostras post-mortem de sangue e cabelo, provenientes de casos sem qualquer suspeita de consumo de GHB. Estes valores foram estatisticamente analisados e comparados no sentido de se averiguar eventuais tendências de comportamento do composto em contexto post-mortem. Os resultados apresentados foram baseados no sexo dos indivíduos, faixa etária, diagnóstico diferencial médico-legal e intervalo post-mortem (intervalo entre a data da morte e a data da autópsia). A concentração média total de GHB em sangue foi de 6,7 g/L, com os valores a variarem entre 1,8 g/L e 15,7 g/L. Em termos de idade dos indivíduos, verificou-se uma descida da concentração do composto à medida que a idade aumenta, com uma média de 7,9 g/L para indivíduos com menos de 44 anos, 6,8 g/L para indivíduos com idades compreendidas entre 45 e 60 anos, e 5,7 g/L para o conjunto de indivíduos com idade superior a 60 anos. Relativamente ao diagnóstico diferencial médico-legal, os valores médios variaram entre 8,9 g/L e 5,1 g/L, consoante a causa de morte referenciada, nomeadamente acidente, causa natural ou suicídio. De notar que nenhum dos casos estudados constituía um contexto de homicídio. Finalmente, e considerando o intervalo post-mortem, foram encontrados valores médios que variaram entre 4,57 mg/L com 4 dias de PMI e 8,29 mg/L com 2 dias de PMI.
- Quantification of GHB by SPE and GC-MS-MS in whole blood samples for forensic purposesPublication . Castro, André Lobo; Dias, Mário; Reis, Flávio; Teixeira, HelenaIntroduction: Gamma-Hydroxybutyrate (sodium hydroxybutyrate; sodium oxybutyrate; GHB) is known to be an endogenous, naturally occurring, short-chained fatty acid found in mammalian tissues, with wide distribution and action in several brain areas (hipothalamus, basal ganglia). Although it was first synthesised in 1960, it soon was noticed that it is no more than an endogenous compound. With more than 30 years of clinical use, both in Europe and the U.S.A, its illicit use includes recreational use, muscle building effects in bodybuilders and drug-facilitated sexual abuse. Used as a club drug, alone or mixed with other substances, it´s symptoms mimetize MDMA, ketamine and ehtanol. On the ohter hand, it is also used for drug-facilitated sexual abuse (DFSA) purposes. Aim: In this work, the authors developed and validated an analytical procedure for GHB detection in whole blood (in vivo and post-mortem), for forensic purposes. Material and Methods: The analytical method was developed preparing the samples by a SPE procedure with MCX OASIS® cartridges, followed by derivatization with BSTFA-TMCS (99:1) and instrumental analysis developed by GC-MS-MS in a Triple Quadrupole apparatus (BRUKER). Results and Discussion: The described method shows good fitness for purpose for whole blood samples. The obtained LOD and LOQ were 200 ng/mL, for 100 uL of sample. This increase in sensitivity was obtained due to an optimized SPE procedure and an instrumental technique state-of-the-art. The work range started at 200 ng/mL, far below the suggested cut-off for whole blood samples (5-10 mg/L). These results will allow the possibility to distinguish post-mortem production, endogenous values and external consumption, whenever this diagnosis should be determined, being applicable to forensic purposes.