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- Bílis como matriz alternativa ou complementar na análise de drogas de abuso e benzodiazepinas por imunoensaios. Estudo preliminar.Publication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Mustra, Carla; Margalho, Cláudia; Frias, Eugénia; Fonte Santa, Jerónimo; Mendes, Luis; Mendonça, Ricardo; Franco, João MiguelA bílis é um fluído corporal que contribui para a purificação do fígado, sendo uma das vias de eliminação de xenobióticos e metabolitos que, uma vez presentes na bílis, são excretados nas fezes. Na ausência ou insuficiência da amostra de sangue, em situação post-mortem, a bílis pode ser colhida através da punção direta na vesícula biliar e consequente aspiração. Esta matriz é considerada uma amostra alternativa valiosa, na medida em que pode apresentar valores elevados das substâncias presentes. Objetivo: Verificar a viabilidade do uso de amostras de bílis nas análises de triagem de drogas de abuso e de benzodiazepinas por imunoensaios enzimáticos. Materiais e Métodos: A análise das amostras de bílis foi efetuada num equipamento semi-automático, EVOLIS Twin Plus System, seguindo os mesmos procedimentos do Serviço de Química e Toxicologia Forenses para as amostras de sangue. Foram usados os testes para análise de opiáceos, metabolitos da cocaína, canabinóides, anfetaminas, metanfetaminas e benzodiazepinas da OraSure Technologies, Inc. As amostras de bílis (200μl) foram diluídas com diluente forense numa proporção de 1:4. Paralelamente, nos casos possíveis, foi também analisada a amostra de sangue. Na avaliação dos resultados qualitativos sobre a presença ou ausência das substâncias a pesquisar foram usados os valores de cut-off em vigor para as amostras de sangue. Posteriormente, realizou-se a confirmação por métodos mais sensíveis e precisos, como a cromatografia de gases associada à espetrometria de massa (GC-MS) e a cromatografia líquida associada à espetrometria de massa (LC-MS-MS). Foram analisados 37 casos, 28 dos quais usámos as amostras de sangue e bílis e 9 só com amostra de bílis, por ausência de sangue. Resultados e Conclusão: Obtiveram-se resultados positivos e negativos nas amostras de bílis para drogas de abuso e benzodiazepinas, viabilizando a utilização da técnica de imunoensaios com os procedimentos do sangue. Os resultados negativos obtidos na bílis nos imunoensaios e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS permitem-nos concluir não haver casos de falsos negativos. Relativamente aos resultados positivos obtidos e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS, obtivemos confirmações positivas e negativas, concluindo-se uma possível existência de interferentes com reatividade cruzada nos imunoensaios. Concluindo, é possível a utilização da amostra de bílis para triagem de drogas de abuso e de benzodiazepinas por imunoensaios; que os resultados negativos poderão ser considerados como válidos por esta técnica e que os resultados positivos nem sempre são confirmados positivos por técnicas mais específicas. A amostra de bílis é, contudo, uma boa alternativa pois o número de resultados negativos é significativo em relação aos positivos e a sua análise por imunoensaios contribui para uma resposta mais rápida e menos onerosa para os nossos clientes, com confirmação apenas dos grupos com resultados positivos.
- Estudo de estabilidade de controlo analítico em método multi-substâncias por LC/MS-MS do SQTF.Publication . Mustra, Carla; Fonseca, Suzana; Monsanto, Paula; Franco, João MiguelINTRODUÇÃO/OBJETIVOS O desenvolvimento e validação de métodos analíticos é uma tarefa fundamental e frequente do Serviço de Química e Toxicologia Forenses (SQTF) que envolve o estudo de vários parâmetros como modelo de calibração, seletividade, sensibilidade, exatidão, precisão, estabilidade, entre outros. O grau de complexidade de uma validação aumenta a par com o número de substâncias abrangidas pelo método, bem como com a especificidade de cada substância. Tão ou mais importante que a validação do método é o seu controlo analítico ao longo do tempo, o que designamos por controlo de qualidade interno, o qual permite avaliar o desempenho do método e do equipamento. O SQTF tem vindo a ampliar o leque de substâncias pesquisadas nos seus laboratórios e a melhorar os níveis de sensibilidade dos métodos, com vista a dar resposta às solicitações. Este crescimento e melhoria dos métodos só foi possível devido à aquisição de novos equipamentos, o que implicou desafios acrescidos relativamente a vários aspetos, em particular quanto à metodologia usada para assegurar um controlo de qualidade interno eficaz. O objetivo deste trabalho é demonstrar como um estudo preliminar da estabilidade de um controlo analítico pode contribuir para a adoção de critérios que permitam avaliar o desempenho do método/equipamento ou mesmo conduzir a novas propostas, como por exemplo a escolha de padrões internos. MATERIAL E MÉTODOS Durante 2 meses foi injetado juntamente com as sequências analíticas de confirmação/quantificação de substâncias medicamentosas de amostras de rotina, um controlo analítico preparado a partir de uma amostra branca (sangue onde previamente se confirmou a ausência das substâncias em estudo) fortificada com cerca de 180 substâncias a uma concentração de 50 ng/mL. Foram avaliadas 177 substâncias medicamentosas relativamente à sua resposta ao longo do tempo (razão entre a área do analito e área de padrão interno: clomipramina d3) num total de 13 injeções. O tratamento estatístico dos dados foi efetuado com recurso à aplicação Microsoft Office Excel®. RESULTADOS E DISCUSSÃO Verificou-se que a maioria das substâncias, cerca de 80%, apresentaram um comportamento estável ao longo do período estudado. Identificaram-se, no entanto, algumas substâncias com variações assinaláveis ao longo do tempo, nomeadamente algumas estatinas e benzodiazepinas cujo coeficiente de variação da razão das áreas é superior a 60%. Nestes casos será importante avaliar as causas destas variações cuja correção poderá, eventualmente, ser implementada através da seleção de um padrão interno mais específico. CONCLUSÕES O estudo de estabilidade de um controlo analítico revelou-se uma ferramenta importante para definir critérios de monitorização do desempenho do método e do próprio equipamento. A maioria das substâncias parece ter estabilidade nas condições testadas, no entanto identificaram-se alguns analitos menos estáveis para os quais será adequado selecionar marcadores de estabilidade ou redefinir padrões internos que sejam mais específicos.
- Determinação de rivastigmina, inibidor seletivo da colinesterase cerebral, em amostras de sangue. Aplicação a casos forenses.Publication . Proença, Paula; Castanheira, Alice; Mustra, Carla; Castanheira, Fernando; Franco, João Miguel; Corte Real Gonçalves, FranciscoIntodução: Sempre que ocorre uma situação relevante de pesquisa de um fármaco não incluído no leque de substâncias detetadas, o laboratório dedica-se a implementar a sua técnica de modo a poder ser dada uma resposta à perícia solicitada. A rivastigmina é um inibidor das colinesterases do tipo carbamato, utilizada no tratamento de demência associada à doença de Alzheimer e à doença de Parkinson. Material e Métodos: No procedimento analítico de determinação de rivastigmina, as amostras biológicas foram previamente extraídas por precipitação proteica, utilizando 0,1 mL de amostra, e posteriormente analisadas por LC-MS/MS. A separação cromatográfica foi efetuada com uma coluna de fase reversa e uma fase móvel, em gradiente, constituída por formato de amónia aquoso 2mM e por metanol, a um fluxo de 0,4 mL/min. Na análise por MS/MS foi utilizado um triplo quadrupolo com ionização por electrospray (ESI). A aquisição de dados por monitorização de reações múltiplas (MRM) foi utilizada na deteção e quantificação de rivastigmina (RT= 4,22), de acordo com as seguintes transições: m/z 251,2>206,1 e m/z 251,2>86,2, em modo ESI positivo. Resultados e Discussão: Na validação da técnica analítica apresentada foram avaliados os parâmetros incluídos no procedimento interno de validação de métodos qualitativos e quantitativos em vigor no laboratório de toxicologia forense. Para a quantificação de rivastigmina foi utilizada uma curva de calibração com concentrações compreendidas entre 5 a 100 ng/mL e controlos ajustados a essa gama de trabalho. Foi ainda avaliada a precisão a dois níveis, a 10 e a 50 ng/mL, a precisão intermédia e o limite de repetibilidade (<20%). Quanto à exatidão, a rivastigmina apresenta recuperações médias estatisticamente semelhantes a 100%, comprovando a inexistência de erro sistemático. O método foi aplicado a 8 casos forenses com concentrações sanguíneas de rivastigmina entre 8,1 a 78 ng/mL. Os resultados obtidos da análise de rivastigmina por procedimentos de triagem, de confirmação e de quantificação foram avaliados. Conclusões: O método validado demonstrou ser seletivo, específico, exato, preciso, robusto e linear na gama de trabalho, cumprindo todos os critérios de aceitação exigidos na determinação deste tipo de substâncias em amostras biológicas analisadas no âmbito da toxicologia forense.
- Importância forense dos fármacos que atuam no aparelho cardiovascular. O top 5 dos fármacos mais detetados no SQTF-C em 2023Publication . Mustra, Carla; Proença, Paula; Castanheira, Alice; Castanheira, Fernando; Monsanto, Paula; Franco, João MiguelINTRODUÇÃO: A pesquisa de medicamentos, drogas e álcool constituem a maioria das perícias realizadas no Serviço de Química e Toxicologia Forenses (SQTF). O desenvolvimento de novos métodos de análise ou melhoria da capacidade de deteção de substâncias novas ou já existentes é uma constante neste serviço, pelo que a avaliação estatística dos resultados e a atualização da informação relativamente a novas tendências de mercado (medicamentos e drogas) deve ser realizada com alguma frequência. Atualmente o SQTF pesquisa de forma sistemática mais de 200 substâncias quando é solicitada a análise de medicamentos. Destas, 65% atuam sobre o sistema nervoso central, 20% atuam sobre o aparelho cardiovascular e as restantes 15% pertencem a outros grupos farmacológicos de acordo com a classificação do índice terapêutico. OBJETIVOS: Este trabalho tem como objetivo apresentar quais os fármacos mais detetados no SQTF na delegação do Centro (SQTF-C) no ano de 2023 e indicar os grupos farmacológicos com maior prevalência. Pretende-se estabelecer um paralelismo com a informação recolhida junto do INFARMED relativamente aos medicamentos prescritos e comparticipados, dispensados nas farmácias comunitárias, em Portugal Continental. Este tipo de estudo é um dos mecanismos que permite ao SQTF definir prioridades na pesquisa de substâncias. RESULTADOS/DISCUSSÃO: No ano de 2023 foram solicitadas 1922 análises de medicamentos ao SQTF-C. Em 70% dos casos foram detetadas substâncias medicamentosas. No leque de substâncias pesquisadas de forma sistemática detetaram-se 147 substâncias diferentes, sendo a mais prevalente o Paracetamol, encontrado em 27% dos casos, seguido pela Furosemida (15%), pela Amlodipina (14%) e pelo Bisoprolol (12%), os três últimos pertencentes ao grupo de fármacos que atuam sobre o aparelho cardiovascular. Em quinto lugar, com uma prevalência de 11% surge o Nordiazepam, metabolito de diversas benzodiazepinas como o Diazepam, Clorodiazepóxido, Clorazepato dipotássico, o Cetazolam e o Prazepam. CONCLUSÕES: Os fármacos do Grupo 3. Aparelho cardiovascular, mais concretamente os anti-hipertensores Furosemida (diurético da ansa), Amlodipina (bloqueadores da entrada de cálcio) e Bisoprolol (bloqueador beta) são os mais detetados no SQTF-C logo depois do Paracetamol. No Top 5 das substâncias detetadas inclui-se ainda o Nordiazepam. Estes resultados estão em linha com os dados disponibilizados pelo INFARMED e são expectáveis tendo em conta a prevalência das doenças cardiovasculares que afetam grande parte da população portuguesa.