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- Desenvolvimento de um método por GC-MS para a confirmação de opiáceos em bílisPublication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Franco, João Miguel; Margalho, CláudiaDe acordo com o metabolismo hepático, os xenobióticos e respetivos metabolitos sofrem excreção biliar ou uma possível circulação entero-hepática. Assim, a bílis pode constituir um reservatório de substâncias metabolizadas e excretadas pelo fígado, sendo considerada uma matriz alternativa viável na análise de drogas de abuso. No entanto, são escassos os estudos que se encontram publicados na literatura sobre a sua utilização recorrendo às metodologias analíticas de triagem por imunoensaios seguida de confirmação por cromatografia de gases – espectrometria de massas (GC-MS). O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de confirmação de opiáceos em amostras de bílis por GC-MS após triagem por imunoensaios. A preparação das amostras foi realizada de acordo com as metodologias analíticas validadas e usadas na rotina do Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. para a análise de opiáceos em sangue: triagem por imunoensaios, seguida de precipitação proteica, extração dos analitos com colunas Oasis® MCX (3 mL, 60 mg), derivatização por microondas dos extratos secos obtidos (MSTFA/5% TMCS, 90 segundos) e, posterior confirmação dos analitos presentes por GC-MS. Em todos os casos de triagem positiva para opiáceos, foi possível detetar e confirmar por GC-MS os analitos morfina, codeína e 6-acetilmorfina, com limites de deteção de 10 ng/mL. O método desenvolvido demonstrou ser útil para a confirmação de opiáceos em bílis por GC-MS, após triagem positiva pela técnica de imunoensaios enzimáticos, sobretudo quando a disponibilidade da matriz postmortem é determinada pelo caso sob investigação.
- Viabilidade da amostra de bílis como matriz alternativa na análise de drogas de abuso clássicas por imunoensaiosPublication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Frias, Eugénia; Mustra, Carla; Margalho, Cláudia; Fonte Santa Silva, José Jerónimo; Franco, João MiguelA bílis é um produto de excreção hepática, sendo considerada uma matriz alternativa que pode ser colhida na ausência ou insuficiência de matrizes convencionais ou para complementaridade da análise das mesmas, em situação post-mortem. Esta matriz apresenta uma ampla janela de deteção, comparativamente com o sangue, e elevadas concentrações de drogas e medicamentos e respetivos metabolitos, uma vez que constitui uma via de eliminação de xenobióticos. Na fase de triagem, recorre-se aos imunoensaios enzimáticos, que correspondem a métodos bioanalíticos baseados na interação antigénio-anticorpo, despoletando resultados semi-quantitativos concernentes com a presença ou ausência do analito na amostra. Objetivos: Estudo da viabilidade da bílis, como amostra alternativa, para análise de drogas de abuso clássicas através da técnica de imunoensaios enzimáticos. Materiais e Métodos: A análise das amostras de bílis foi efetuada num equipamento semi-automático, EVOLIS Twin Plus System, seguindo os mesmos procedimentos usados no Serviço de Química e Toxicologia Forenses para as amostras de sangue. Foram usados os testes para análise de opiáceos, metabolitos da cocaína, canabinóides, anfetaminas e de metanfetaminas da OraSure Technologies, Inc. Trata-se de um ensaio competitivo do tipo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) em que, no final é feita a leitura da absorvância de cada amostra, dos controlos e calibradores, sendo o seu valor inversamente proporcional à concentração do analito na amostra. Foram usados os mesmos calibradores cutoff em vigor no SQTF para as amostras de sangue. As amostras de bílis usadas (200μL) foram diluídas em diluente forense, respeitando uma proporção de 1:4. Foram analisados no total 37 casos e posteriormente confirmadas por cromatografia de gases associada à espetrometria de massa (GC-MS) e cromatografia líquida associada à espetrometria de massa (LC-MS-MS). Resultados e Conclusão: Na triagem das amostras de bílis por imunoensaios obtiveram-se resultados positivos e negativos para os diferentes grupos de drogas de abuso, sendo por isso viável a sua utilização através dos procedimentos e protocolos do sangue. Os resultados negativos obtidos e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS permitem-nos excluir a existência de casos de falsos negativos. Alguns dos resultados positivos foram, contudo, confirmados como negativos, evidenciando a existência de interferentes com reatividade cruzada nos diferentes ensaios. Em suma, podemos concluir que a amostra de bílis pode ser usada na triagem de drogas de abuso clássicas por imunoensaios enzimáticos. Sendo uma boa alternativa pois os resultados negativos num ou mais grupos levam a que apenas os positivos sejam confirmados por técnicas mais específicas e demoradas, contribuindo assim para uma resposta mais rápida e menos dispendiosa.
- Bílis como matriz alternativa ou complementar na análise de drogas de abuso e benzodiazepinas por imunoensaios. Estudo preliminar.Publication . Dinis, Pedro; Monsanto, Paula; Mustra, Carla; Margalho, Cláudia; Frias, Eugénia; Fonte Santa, Jerónimo; Mendes, Luis; Mendonça, Ricardo; Franco, João MiguelA bílis é um fluído corporal que contribui para a purificação do fígado, sendo uma das vias de eliminação de xenobióticos e metabolitos que, uma vez presentes na bílis, são excretados nas fezes. Na ausência ou insuficiência da amostra de sangue, em situação post-mortem, a bílis pode ser colhida através da punção direta na vesícula biliar e consequente aspiração. Esta matriz é considerada uma amostra alternativa valiosa, na medida em que pode apresentar valores elevados das substâncias presentes. Objetivo: Verificar a viabilidade do uso de amostras de bílis nas análises de triagem de drogas de abuso e de benzodiazepinas por imunoensaios enzimáticos. Materiais e Métodos: A análise das amostras de bílis foi efetuada num equipamento semi-automático, EVOLIS Twin Plus System, seguindo os mesmos procedimentos do Serviço de Química e Toxicologia Forenses para as amostras de sangue. Foram usados os testes para análise de opiáceos, metabolitos da cocaína, canabinóides, anfetaminas, metanfetaminas e benzodiazepinas da OraSure Technologies, Inc. As amostras de bílis (200μl) foram diluídas com diluente forense numa proporção de 1:4. Paralelamente, nos casos possíveis, foi também analisada a amostra de sangue. Na avaliação dos resultados qualitativos sobre a presença ou ausência das substâncias a pesquisar foram usados os valores de cut-off em vigor para as amostras de sangue. Posteriormente, realizou-se a confirmação por métodos mais sensíveis e precisos, como a cromatografia de gases associada à espetrometria de massa (GC-MS) e a cromatografia líquida associada à espetrometria de massa (LC-MS-MS). Foram analisados 37 casos, 28 dos quais usámos as amostras de sangue e bílis e 9 só com amostra de bílis, por ausência de sangue. Resultados e Conclusão: Obtiveram-se resultados positivos e negativos nas amostras de bílis para drogas de abuso e benzodiazepinas, viabilizando a utilização da técnica de imunoensaios com os procedimentos do sangue. Os resultados negativos obtidos na bílis nos imunoensaios e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS permitem-nos concluir não haver casos de falsos negativos. Relativamente aos resultados positivos obtidos e confirmados por GC-MS ou LC-MS-MS, obtivemos confirmações positivas e negativas, concluindo-se uma possível existência de interferentes com reatividade cruzada nos imunoensaios. Concluindo, é possível a utilização da amostra de bílis para triagem de drogas de abuso e de benzodiazepinas por imunoensaios; que os resultados negativos poderão ser considerados como válidos por esta técnica e que os resultados positivos nem sempre são confirmados positivos por técnicas mais específicas. A amostra de bílis é, contudo, uma boa alternativa pois o número de resultados negativos é significativo em relação aos positivos e a sua análise por imunoensaios contribui para uma resposta mais rápida e menos onerosa para os nossos clientes, com confirmação apenas dos grupos com resultados positivos.