Validação do Ensaio Investigator 26Plex QS nos Laboratórios do Porto do SGBF: resultados preliminares

Magalhães, Paulo; Amorim, António; Ferreira da Silva, Benedita

http://hdl.handle.net/10400.26/59414

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Validação do Ensaio Investigator 26Plex QS nos Laboratório do Porto do SGBF - Estudos preliminares.pdf		3.31 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Magalhães, Paulo

Amorim, António

Ferreira da Silva, Benedita

Abstract(s)

Introdução O SGBF-N é um serviço acreditado pelo IPAC, pelo que todos os reagentes e equipamentos em uso têm de ser validados internamente em função do PG-SGBF-001. Recentemente, foi adquirido um novo kit de amplificação, Investigator26Plex QS, que partilha 25 polimorfismos com o PowerPlex Fusion 6C, utilizadoatualmente no SGBF-N, possuindo ainda dois marcadores adicionais de controlo interno de qualidade. Estes possibilitam a avaliação da eficácia da amplificação, a integridade da amostra e a eventual presença de inibidores, apresentando-se como uma potencial alternativa aos kits atualmente em uso. Este trabalho pretende apresentar parte do processo de validação e consequentes resultados obtidos até à data pelo SGBF-N. Material e Métodos Numa primeira análise foram determinados os limiares analíticos, tendo, para tal, sido analisados 50 brancos de amplificação. Para a análise da especificidade foram analisadas diferentes espécies de animais somando 34 amostras no total. As amostras utilizadas para a análise da sensibilidade apresentaram um intervalo de concentração de ADN de 10-0,001ng/μL. De forma a otimizar recursos, foi reduzido o volume final de reação para metade do descrito na bula, assim como foi reduzido o número de ciclos, de 30 para 27. De modo a analisar os parâmetros reprodutibilidade e a repetibilidade, foram analisados o mesmo grupo de amostras em 3 dias diferentes, por 3 operadores diferentes. Em paralelo a todos os ensaios descritos, foram amplificadas amostras de natureza distinta - zaragatoas bucais extraídas com PrepFiler e Prep-n-Go, assim como manchas de sangue recolhidas post mortem e in vivo, extraídas e de forma direta - de modo a garantir que o kit mantém a eficácia. No procedimento laboratorial foram utilizados termocicladores GeneAmp PCR System 9700 e Veriti Thermal Cycler e o sequenciador 3500 Genetic Analyzer. Resultados e Discussão Na análise dos perfis genéticos das amostras animais, observou-se ausência total de amplificação permitindo concluir que o 26plex é exclusivo ao ADN humano. Analisados os resultados da sensibilidade verificou-se que partir da concentração 0,01ng/μl o kit começou a apresentar dropout alélico. Os resultados obtidos quando as mesmas amostras foram analisadas nas mesmas circunstâncias, mas em dias e por operadores diferentes mostraram-se sobreponíveis. A redução da quantidade de reagentes para metade e do número de ciclos para 27 permitiram a obtenção de perfis genéticos com os padrões de qualidade definidos pelo serviço. Conclusões Com os procedimentos efetuados foi possível proceder à otimização do kit, pretendendo continuar a validação futuramente para os parâmetros em falta, nomeadamente, análise de contaminação e presença de inibidores em amostras de referência, determinação de limiares de heterozigotia, entre outros. Com isto espera-se ter uma alternativa acreditada para a análise das amostras recebidas no SGBF-N.