Loading...
2 results
Search Results
Now showing 1 - 2 of 2
- Influência do tipo de zaragatoa bucal na obtenção de perfis genéticosPublication . Dario, Ana Rita; Dourado, Catarina; Pimentel, Mariana; Lucas, Isabel; Marcelino, Miguel; Vieira da Silva, Cláudia; Amorim, AntónioNo âmbito das investigações biológicas forenses é necessário utilizar amostras de referência, geralmente sangue ou saliva. Estas amostras, se colhidas corretamente e armazenadas em condições adequadas, não apresentam problemas de escassez de material genético e mantêm-se estáveis, por um longo período de tempo. Atualmente, no SGBF-S são preferencialmente colhidas, apenas, duas zaragatoas bucais, a cada interveniente, sendo por isso, de extrema importância, a utilização do tipo de zaragatoas mais adequado para este tipo de colheita, visto que não existirá, como alternativa, o suporte de mancha de sangue. Assim, para além de outros fatores, nomeadamente o correto acondicionamento e preservação das amostras colhidas, existe um de grande importância a considerar - o tipo de suporte - uma vez que pode condicionar a quantidade de ADN presente na amostra. O presente trabalho pretende identificar se a ausência da obtenção de um perfil genético completo está relacionada com o tipo de zaragatoa usada na colheita da amostra. Foram analisadas amostras extraídas com Prep-n-Go™ Buffer (Applied Biosystems™), amplificadas para STRs autossómicos com os kits PowerPlex® Fusion 6C System (Promega Corporation) e GlobalFiler™ PCR Amplification (Applied Biosystems™). ™). A análise de fragmentos foi efetuada por eletroforese capilar no sequenciador automático 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems™) e analisadas com o software GeneMapper® ID-X 1.4 (Applied Biosystems™). Nos casos em que não foi obtido um perfil completo, repetiu-se a extração com um kit mais sensível e eficaz – PrepFiler Express™ Forensic DNA Extraction (Applied Biosystems™), e posteriormente a quantificação com o kit Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit (Applied Biosystems™) desta nova extração, como da anterior. Apesar da grande eficácia e sensibilidade desta metodologia de extração, nem sempre foi possível obter um perfil genético valorizável. Para a resolução de algumas perícias, foi possível recorrer à amostra complementar (mancha de sangue) e realizar os procedimentos laboratoriais adequados. Noutras situações, foi mesmo necessário proceder a nova colheita. Na casuística do Laboratório, verificou-se que a ausência de perfis genéticos ou presença de perfis não valorizáveis ou incompletos está, frequentemente, relacionada com o tipo de zaragatoa utilizada na colheita de células do epitélio bucal. Assim, concluiu-se que o tipo de zaragatoa dentada, de extremidade descartável, conduz regularmente à obtenção de um perfil genético robusto. Após o estudo efetuado, recomenda-se o uso de zaragatoas dentadas com extremidade descartável, em detrimento de outros tipos de zaragatoas bucais.
- Internal Validation of the Investigator 26Plex QS Amplification Kit: a high-throughput multiplex assay for reference and low copy number DNA samplesPublication . Cardoso, Paula; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virginia; Dario, Rita; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroThe Investigator® 26plex QS Amplification Kit, from QIAGEN, provides reliable and rapid DNA profiles while enabling the multiplex amplification of 24 STRs, 2 Quality Sensors and a gender-determining marker, Amelogenin. The Quality Sensors incorporated in this kit provide insight into the sample quality and the PCR's success while alerting to the presence of inhibitors. Through an extensive internal validation study, this research sought to implement the Investigator® 26plex QS in the laboratory routine of the Forensic Genetic and Biology Service, Central branch (SGBF-C) of the Portuguese National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences. Here we detail the procedures and parameters applied which followed the SWGDAM guidelines, as well as report the results obtained throughout. Firstly, it was crucial to establish unique analytical criteria that would be the baseline for the interpretation of the results obtained. To accomplish such, analytical, stochastic, heterozygous balance and stutter thresholds were defined. Thereupon, this study intended to gauge the kit’s performance, by evaluating its concordance with normalized methodologies while assessing its sensitivity, specificity, robustness, and precision, besides its efficiency in the presence of degraded and/or inhibited samples. Lastly, in favour of optimizing the laboratory workflow, an assay was carried out to test half volume reactions and direct amplification on reference samples. In this study a wide range of sample types were analysed, which made it possible to acquire robust data pertaining to the performance of the assay. The laboratory methodology applied comprehended: DNA extraction using Prep-n-Go™ Buffer and PrepFiler Express™ Forensic DNA Extraction Kit, quantification with the Quantifiler™ Trio Quantification Kit, followed by the amplification with the Investigator® 26plex QS. Capillary electrophoresis was performed in the Applied Biosystems™ 3500 Genetic Analyzer, and the electropherograms’ were analysed using the GeneMapper™ ID-X Software v1.6. Through this work, it was possible to characterize the main advantages of the Investigator® 26plex QS kit, as well as its limitations. The validation data demonstrated that this system produces reliable profiles in the presence of minute DNA quantities and identifies the minor contributor in a mixture up to a 1:50 ratio. The results inferred a high human specificity, robustness, and sensitivity, while producing concordant and reproducible results with optimized protocols for both reference and low copy number DNA samples. Through concordance studies it was further shown that there is a high consistency between this novel amplification kit and those currently implemented in the SGBF-C, thus proving its suitability for the analysis of forensic samples.