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- Avaliação Direta do Kit Investigator® 26plex QS com outros Kits utilizados na rotina laboratorial do SGBF-CPublication . Cardoso, Paula; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Cunha, Patrícia; Shataskova, Alena; São Bento, Marta; Bento, Ana Margarida; Sampaio, Lisa; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroA identificação individual carece do estudo e caracterização de marcadores polimórficos presentes no ADN, sendo a análise de Short Tandem Repeats (STRs) a metodologia de eleição em Genética Forense. A introdução da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) revolucionou a área forense, dado que permite a obtenção de inúmeras cópias de ADN, através da amplificação de sequências específicas de interesse. O contínuo desenvolvimento científico e o aparecimento de novas metodologias, compele à atualização dos procedimentos laboratoriais implementados, de forma a rentabilizá-los e torná-los mais eficientes. No entanto, a implementação de uma metodologia, num laboratório acreditado, requer uma validação interna que compreende uma análise extensiva a fim de confirmar a sua adequabilidade. A avaliação direta por comparação com métodos desenvolvidos constitui uma fase crucial deste processo. O kit Investigator® 26plex QS, da QIAGEN, assenta numa reação de PCR multiplex, através da amplificação simultânea de 24 STRs, 2 Sensores de Qualidade e Amelogenina. Os Sensores de Qualidade inclusos neste kit de amplificação permitem inferir sobre a qualidade da amostra e o sucesso da reação de PCR, alertando, igualmente, para a presença de inibidores. Com o objetivo de avaliar o kit Investigator® 26plex QS, nomeadamente por comparação direta com as metodologias já implementadas e validadas no SGBF-C, o GlobalFiler™ PCR Amplification Kit e o PowerPlex® Fusion 6C System, foram selecionadas 24 amostras para amplificação (PE-SGBF-C-001 Rev09, Determinação de perfil genético de ADN por PCR/eletroforese capilar a partir de amostras de referência de sangue e saliva – procedimento interno do SGBF-C). A eletroforese capilar realizou-se no sequenciador automático ABI PRISM® 3500 Genetic Analyzer, seguindo-se a análise dos eletroferogramas através do software GeneMapper™ ID-X 1.6. Neste estudo foi possível constatar que os perfis genéticos obtidos com o kit Investigator® 26plex QS são concordantes com os perfis resultantes da análise através das metodologias supramencionadas. Adicionalmente, os dados preliminares deste trabalho evidenciam o potencial deste kit de amplificação e sugerem tratar-se de uma metodologia robusta de análise. Sendo, não obstante, imprescindível a realização de estudos complementares de validação.
- Validação e implementação do painel Precision ID GlobalFilerTM NGS STR v2 em amostras forensesPublication . Catré, Inês; Shastakova, Alena; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Cunha, Patrícia; São Bento, Marta; Bento, Ana Margarida; Sampaio, Lisa; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroO Serviço de Genética e Biologia Forenses do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. da Delegação do Centro (SGBF-C) pretende implementar a metodologia de Next Generation Sequencing (NGS) aplicada a Short Tandem Repeats (STRs) autossómicos. Com esse propósito foi realizado um estudo para validação do painel Precision ID GlobalFilerTM NGS STR panel v2 da Applied Biosystems ThermoFisher Scientific. Esta tecnologia permite realizar a sequenciação de um elevado número de fragmentos de ADN por amostra, levando à determinação de um maior número de alelos por marcador genético, não detetáveis através da metodologia usualmente utilizada para STRs autossómicos no SGBF-C. Antes de realizar a implementação de uma nova metodologia na rotina de um laboratório acreditado é necessário testar e validar o novo método. Neste estudo foram selecionadas várias amostras de processos criminais e de processos de parentesco, previamente analisadas por Eletroforese Capilar (EC), pretendendo-se avaliar o potencial desta nova metodologia, nomeadamente através do aumento do poder de discriminação. Durante todo o procedimento foram seguidas as recomendações da casa comercial para a utilização deste painel, com recurso aos equipamentos HID Ion ChefTM e Ion S5TM System. Após a análise dos resultados com o ConvergeTM Software, e realizando uma comparação com os resultados previamente obtidos para EC, foi possível concluir que o painel de GlobalFiler para NGS traz algumas vantagens em relação ao kit GlobalFiler™ PCR Amplification para EC. No entanto, antes da sua implementação, deverão ser realizados mais alguns estudos complementares de validação.
- O efeito de inibidores na amplificação de STRs autossómicos pelo kit Investigator® 26Plex QSPublication . Cardoso, Paula; Serra, Armando; Bogas, Vanessa; Balsa, Filipa; Lopes, Virgínia; Porto, Maria João; Amorim, António; Corte Real, F.; Brito, PedroA metodologia de PCR – reação em cadeia de polimerase – constitui-se como a metodologia de eleição na análise de amostras biológicas em Genética e Biologia Forenses. O material genético colhido em cenas de crime ou em cadáveres encontra-se frequentemente exposto ao meio ambiente e/ou a diferentes inibidores, levando a uma ineficiente amplificação dos marcadores genéticos. De entre os inibidores mais frequentemente encontrados em amostras problema incluem-se: etanol, índigo-carmim, solo argiloso, solo humoso e folhagem. Os mecanismos de ação destes inibidores contemplam uma ineficiente lise celular que impossibilita a ação da Taq polimerase e a extensão da cadeia nucleotídica. Em particular, o solo age como fator de inibição e de degradação, dado que os seus componentes minerais se ligam às partículas de ADN e alteram a conformação da molécula. Adicionalmente as plantas e microrganismos presentes no solo utilizam o material biológico depositado como fator de crescimento, degradando-o. Por conseguinte, verifica-se uma amplificação preferencial de alelos de menor dimensão e a ocorrência de drop-out alélico. Para aferir a capacidade do kit Investigator 26Plex QS da Qiagen, em produzir resultados válidos e interpretáveis na presença dos inibidores supramencionados, prepararam-se amostras simuladas a diferentes proporções Inibidor vs ADN, nomeadamente 1:10, 1:1 e 10:1. Para a conceção das soluções de inibidores utilizou-se solução stock de etanol a 70%, preparou-se uma solução de índigo-carmim a 12mM e no que diz respeito, à folhagem, solo argiloso e solo humoso, 1g de cada inibidor foi adicionado a aproximadamente 2mL de água nuclease free para a obtenção de uma mistura homogénea. Após a preparação das amostras simuladas compostas por ADN controlo e solução inibitória, estas foram introduzidas num lote de amostras não contaminadas para se averiguar a capacidade do kit manter o seu adequado desempenho e para determinar o quão informativos são os controlos de qualidade incluídos neste. Com este trabalho foi possível demonstrar que para as proporções 1:10 e 1:1, é possível obter perfis genéticos completos com elevada intensidade de fluorescência e sem o aparecimento de artefactos. Contudo, para concentrações elevadas de inibidor - em que o input máximo de ADN era 0,1 ng - verificou-se uma redução abruta na performance do kit de amplificação com drop-out alélico dos STRs de maior tamanho. Complementarmente, através deste ensaio verificou-se que os controlos de qualidade inclusos no kit da Qiagen não permitiram aferir pela presença de inibidores nas amostras, observando-se resultados similares entre as amostras simuladas e as do grupo controlo. Atendendo que a extração de ADN remove uma quantidade elevada de material exógeno de uma amostra, a concentração de inibidores aquando da amplificação será mais reduzida. Por conseguinte, os resultados deste trabalho demonstram que este kit de amplificação permite a obtenção de um perfil genético válido e robusto.