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- A Blood–bone–tooth model for age prediction in forensic contextsPublication . Correia Dias, Helena; Manco, Licínio; Corte Real, F.; Cunha, EThe development of age prediction models (APMs) focusing on DNA methylation (DNAm) levels has revolutionized the forensic age estimation field. Meanwhile, the predictive ability of multi-tissue models with similar high accuracy needs to be explored. This study aimed to build multi-tissue APMs combining blood, bones and tooth samples, herein named blood–bone–tooth-APM (BBT-APM), using two different methodologies. A total of 185 and 168 bisulfite-converted DNA samples previously addressed by Sanger sequencing and SNaPshot methodologies, respectively, were considered for this study. The relationship between DNAm and age was assessed using simple and multiple linear regression models. Through the Sanger sequencing methodology, we built a BBT-APM with seven CpGs in genes ELOVL2, EDARADD, PDE4C, FHL2 and C1orf132, allowing us to obtain a Mean Absolute Deviation (MAD) between chronological and predicted ages of 6.06 years, explaining 87.8% of the variation in age. Using the SNaPshot assay, we developed a BBT-APM with three CpGs at ELOVL2, KLF14 and C1orf132 genes with a MAD of 6.49 years, explaining 84.7% of the variation in age. Our results showed the usefulness of DNAm age in forensic contexts and brought new insights into the development of multi-tissue APMs applied to blood, bone and teeth
- Estimativa da idade epigenética em ossos: avaliação dos níveis de metilação de DNA no gene FHL2 por droplet digital PCRPublication . Correia Dias, Helena; Manco, LicínioA estimativa da idade epigenética é uma abordagem inovadora em contextos forenses, sendo os ossos uma das amostras mais relevantes no campo legal. Nos últimos anos, o nosso grupo construiu vários modelos de predição de idade (age prediction models, APMs), em diferentes tecidos biológicos, usando diferentes metodologias para a análise dos níveis de metilação de DNA (DNAm), nomeadamente sequenciação de Sanger e SNaPshot. Contudo, a avaliação dos níveis de metilação pode ser influenciada pelo método, com consequências na precisão da estimativa da idade. Recentemente, o nosso grupo desenvolveu diversos APMs específicos para amostras de sangue de indivíduos vivos e mortos, utilizando a técnica de droplet digital PCR (ddPCR). O presente trabalho teve como objetivo avaliar os níveis de DNAm do gene FHL2 em ossos de indivíduos portugueses usando a técnica de ddPCR com vista a desenvolver um APM aplicável a laboratórios forenses. Foram recolhidas 26 amostras de ossos (4 mulheres, 22 homens, com idades entre 26 a 80 anos) durante autópsias médico-legais no Serviço de Patologia Forense da Delegação do Centro e do Sul do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, depois de consultar o Registo Nacional de Não Dadores, durante o período de 2018 a 2020. Após extração, o DNA foi submetido a conversão por bissulfito de sódio, a que se seguiu a análise com um ensaio duplex-ddPCR visando o DNA metilado e o DNA não-metilado do CpG cg06639320 localizado no gene FHL2, durante o ano de 2024. Os ensaios foram realizados no sistema QX100™ Droplet Digital™ PCR (Bio- Rad, CA, USA). A relação entre a idade cronológica e os níveis de DNAm foi avaliada por regressão linear simples recorrendo ao software IBM SPSS, v.27. Foi obtida uma forte correlação entre os níveis de DNAm e a idade (R = 0,849; P = 4,136 x 10-8), explicando 71% da variação na idade (R2 ajustado). O APM construído com os coeficientes estatísticos revelou um valor médio do desvio entre a idade cronológica e prevista, [mean absolute deviation between chronological and predicted ages (MAD)], de 6,09 anos. A precisão do APM foi avaliada através de 3-fold cross validation obtendo-se uma MAD média de 6,44 anos. Comparando estes resultados com os previamente publicados pelo nosso grupo em ossos para o mesmo CpG usando as técnicas de sequenciação de Sanger e SNaPshot observou-se neste estudo um valor superior de correlação DNAm vs. idade e um valor de MAD inferior, evidenciando um aumento na precisão dos APMs construídos por ddPCR. Os resultados obtidos reforçam a utilidade da ddPCR para a estimativa da idade epigenética. O APM desenvolvido revela melhor precisão na estimativa da idade comparativamente à precisão reportada previamente usando a mesma amostra com diferentes métodos, podendo colocar a técnica de ddPCR como uma das mais promissoras para avaliação de níveis de DNAm a ser implementada em laboratórios forenses.