IPS - ESTB - BIBLIOTECA - Dissertações de mestrado
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Esta coleção reúne dissertações, trabalhos de projeto e relatórios de estágio, no âmbito de cursos de 2.º ciclo (mestrados), em formato digital.
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Browsing IPS - ESTB - BIBLIOTECA - Dissertações de mestrado by Author "Albuquerque, Bárbara Filipa Agostinho"
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- Production and characterization of INTERLEUKIN-9 and its receptorPublication . Albuquerque, Bárbara Filipa Agostinho; Mikulecky, Pavel; Schneider, Bohdan; Justino, Marta CamposO principal objetivo deste projeto foi proceder á descoberta da estrutura da Interleucina-9 e do seu respetivo recetor. Esta Interleucina mostrou uma ligação positiva com inflamações, asma e alergias. Por este motivo a descoberta das suas estruturas é essencial para o desenvolvimento de um inibidor eficaz. Para atingir este objetivo, este projeto foi dividido em dois objetivos principais. O primeiro baseou-se na produção e purificação da Interleucina-9 e do seu recetor. No segundo objetivo, procedeu-se à caracterização biofísica e cristalização das proteínas produzidas. Para alcançar o primeiro objetivo, procedeu-se à utilização de vários vetores de modo a obter construções finais com o fim de melhorar a produção e a solubilidades destas duas proteínas. Ambas as proteínas foram expressas em todas as estirpes testadas. No entanto, o principal problema que enfrentamos ao usar células de E. coli foi o facto de todas as proteínas expressas encontravam-se em corpos de inclusão. Resultado em proteínas insolúveis. Embora não tivéssemos conseguido o refold da proteína para uma proteína solúvel, os resultados obtidos foram bastante promissores. No futuro, seria necessário repetir mais técnicas de refold de proteínas ou construções de vetores diferentes. Além da produção em E. coli, também executamos a produção destas proteínas em células Schneirder 2 (S2), sendo estas células de inseto. Obtivemos uma boa expressão de ambas as proteínas e estas encontravam-se na forma solúvel. Com estas proteínas produzidas procedemos para a caracterização biofísica e cristalização destas. Primeiro foi medida a espectro de dicroísmo circular que nos mostrou que ambas as proteínas estavam devidamente bem enroladas. Após a confirmação do complexo da Interleucina-9 com o recetor, lemos a temperatura de fusão da Interleucina-9 sozinha e do complexo. Estas medições mostraram que o complexo é mais estável que o recetor da Interleucina-9 sozinho. A prova final de interação entre estas duas proteínas foi medida através da afinidade entre estas por uma Termoforese em Microescala (MST). As curvas medidas evidenciaram uma ligação adequada entre estas proteínas. Finalmente, procedeu-se à cristalização da Interleucina-9 sozinha e do complexo. Infelizmente não obtivemos nenhuma forma cristalina do complexo após 51 dias de controle continuo. Ao contrário da Interleucina-9, com esta proteína for possível detetar a presença de duas formas cristalinas após dois dias. Os nossos ensaios iniciais deram resultados, porém os nossos esforços futuros serão aplicados em maior profundidade na otimização das condições de cristalização de ambas as proteínas e do complexo.