IPC - ESTeSC - Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Coimbra
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- Characterization of Legionella species by numerical analysis of whole-cell protein electrophoresisPublication . Veríssimo, António; Morais, Paula V.; Diogo, Alexandra; Alcobia Gomes, Célia Margarida; Costa, Milton S. daThe results of a computer-assisted whole-cell protein sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of 291 isolates and 74 reference strains belonging to all known species of the genus Legionella revealed that the majority of the species of this genus can be adequately identified by this method. The type strain of Legionella bozemanii did not cluster with the other strains of this species, and the only strain of Legionella geestiana available clustered with the strains of Legionella feeleii. When we performed a numerical analysis by omitting certain portions of the pattern containing dense bands, all of the species could be distinguished. Our results also show that the type strains of Legionella nautarum and Legionella londiniensis deposited in the National Collection of Type Cultures do not correspond to the type strains deposited in the American Type Culture Collection. We used the results of a fatty acid and ubiquinone composition analysis to complement the SDS-PAGE results for several strains whose identities as determined by indirect immunofluorescence were doubtful. Computer-assisted SDS-PAGE of whole-cell proteins can be used in the classification of Legionella species and to identify and screen large numbers of isolates for further, in-depth taxonomic studies of smaller numbers of strains.
- Computer-aided comparison of protein electrophoretic patterns for grouping and identification of heterotrophic bacteria from mineral waterPublication . Ferreira, A.C.; Morais, Paula V; Alcobia Gomes, Célia Margarida; Da Costa, MiltonThe microflora of a natural mineral water was studied immediately after bottling (T0) and after 7 d storage (T7) during 6 months, and isolates were clustered by SDS-PAGE of whole-cell protein profiles. Isolates from each cluster were further characterized by API 20NE, fatty acid composition and quinone profiles. The numerical analysis of the electrophoregrams of all bacteria isolated from the mineral water formed 15 clusters and five unclustered strains. Except for five minor clusters, all clusters were composed of strains isolated over several months. The numerical analysis of the electrophoregrams of bacteria isolated immediately after bottling formed 15 clusters while after 7 d storage only four of these populations could be isolated, indicating that populations present in the mineral water were stable and that changes occurring after bottling probably resulted from a selection process. Only one unclustered strain was identified simultaneously by all the systems, as Sphingomonas paucimobilis. The monitoring of the aquifer and the bottling system, and the construction of a large database with bacteria of the autochthonous flora allows the detection of alterations in the aquifer by changes in the microflora.
- New molecular markers for phlebotomine sand fliesPublication . Peixoto, Alexandre Afrânio; Alcobia Gomes, Célia Margarida; de Amoretty, P.R.; Lins, R.M.M.A.; Meireles-Filho, A.C.A.; de Souza, N.A.; Kyriacou, C.P.Using degenerate-primers PCR we isolated and sequenced fragments from the sand fly Lutzomyia longipalpis homologous to two behavioural genes in Drosophila, cacophony and period. In addition we identified a number of other gene fragments that show homology to genes previously cloned in Drosophila. A codon usage table for L. longipalpis based on these and other genes was calculated. These new molecular markers will be useful in population genetics and evolutionary studies in phlebotomine sand flies and in establishing a preliminary genetic map in these important leishmaniasis vectors.
- Molecular evolution of the period gene and phylogeny of neotropical sandfliesPublication . Mazzoni, C.J.; Alcobia Gomes, Célia Margarida; Souza, N.A.; Queiroz, R.G.; Justiniano, S.C.B.; Ward, R.D.; Kyriacou, C.P.; Peixoto, Alexandre AfrânioThe molecular evolution of the clock gene period was studied in Phlebotomine sandflies (Diptera: Psychodidae). Comparison of the synonymous and nonsynonymous substitution rates between sandflies and Drosophila revealed a significantly higher evolutionary rate in the latter in three of the four regions analyzed. The differences in rate were higher in the sequences flanking the Thr-Gly repetitive domain, a region that has expanded in Drosophila but remained stable and short in sandflies, a result consistent with the coevolutionary scenario proposed for this region of the gene. An initial phylogenetic analysis including eight neotropical sandfly species and one from the Old World was also carried out. The results showed that only the subgenus Nyssomyia is well supported by distance (neighbor-joining) and maximum parsimony analysis. The grouping of the other species from the subgenus Lutzomyia and Migonei group shows very low bootstrap values and is not entirely consistent with classical morphological systematics of the genus Lutzomyia.
- Avaliação da actividade da proteína C E expressão de CD64 nos neutrófilos como marcadores de diagnóstico precoce na sepsisPublication . Oliveira, Ana Cristina da Silva; Ribeiro, Maria Letícia de Sousa; Fidalgo, Teresa de Jesus SemedoIntrodução: Na investigação da fisiopatologia dos distúrbios hemostáticos de doentes com sepsis, a proteína C (PC) tem despertado um interesse particular devido ao seu papel central nos sistemas da coagulação e fibrinólise. Na sepsis há diminuição dos níveis de PC, resultante do aumento de consumo, degradação e/ou diminuição de síntese, e os níveis baixos têm sido apontados como predictores de severidade e grau de disfunção orgânica. Na região promotora do gene da PC (PROC) há dois polimorfismos funcionais, -1654C/T e -1641A/G, que foi demonstrado que condicionam os níveis de PC em indivíduos normais e, mais recentemente, tem vindo a ser discutido o seu papel como factor agravante na sepsis. A expressão do CD64 nos neutrófilos tem sido proposta como um indicador laboratorial de infecção severa e sepsis. O receptor membranar definido pelo anticorpo monoclonal CD64 é um receptor de elevada afinidade para imunoglobulinas (FcγRI) e é expresso nos monócitos maduros e em níveis muito baixos nos neutrófilos não activados. O aumento da expressão do CD64 nos neutrófilos parece ser um marcador sensível de infecção e sepsis. Objectivos: O objectivo principal deste estudo foi analisar, nos doentes com sepsis, alterações precoces dos níveis da PC e da expressão do CD64 nos neutrófilos e pesquisar a sua correlação com a severidade e prognóstico da doença. Foi ainda analisada a correlação entre os polimorfismos, -1654C/T, -1641A/G e -1476A/T na região promotora do gene PROC e os níveis de PC e a severidade da sepsis. Material & Métodos: Trinta e sete doentes com sepsis foram agrupados em 3 grupos, consoante a severidade: 1) sepsis (n = 10), 2) sepsis severa (n = 8), 3) choque séptico (n = 19). Aquando da admissão na Unidade de Cuidados Intensivos (ICU) foram quantificados os níveis de proteína C, fibrinogénio, d-dímeros, procalcitonina e proteína C reactiva e a expressão de CD64 nos neutrófilos (pelas metodologias de citometria de fluxo convencional e do CD-Sapphire). Posteriormente foram pesquisados os polimorfismos da região promotora do gene PROC. Cinquenta voluntários saudáveis foram estudados como grupo controlo para determinação dos níveis de PC, análise do genótipo da região promotora PROC e determinação dos níveis de expressão do CD64 nos neutrófilos. Para análise estatística dos resultados foi utilizado o programa Graph Pad Prism versão 5.00. Resultados: Observou-se uma diminuição dos níveis de PC com o agravamento dos estadios de sepsis (p=0.0018), com níveis mais baixos no grupo de doentes com choque séptico. No grupo controlo verificou-se uma diferença estatisticamente significativa (-16%; p=0.0375) nas médias dos níveis de PC entre os indivíduos com os genótipos TT/AA/AA (116%) e CC/GG/TT (100%). Relativamente aos doentes com sepsis, observou-se uma diferença estatisticamente significativa na média dos níveis de PC entre o grupo do genótipo CC/AA/AA (81%) comparado aos grupos com os genótipos TT/AA/AA (35.5%; p=0.0350) e CC/GG/TT (30%; p=0.0009). A expressão de CD64 nos neutrófilos, por ambas as metodologias, está aumentada nos doentes com sepsis em relação ao grupo controlo (diferença com significado estatístico, p<0.0001); o número de moléculas de CD64 por célula (por citometria de fluxo) aumenta gradualmente com a severidade da sepsis, com níveis mais elevados no choque séptico. Conclusão: Neste grupo de doentes com sepsis, avaliados no momento em que deram entrada na UCI, os níveis de PC e a expressão de CD64 nos neutrófilos permitem confirmar o diagnóstico; o número de moléculas de CD64 /célula correlacionam-se significativamente com a severidade da sepsis, fornecendo uma informação adicional fidedigna para a avaliação da gravidade do quadro clínico. Este estudo confirmou a correlação entre os polimorfismos -1654C/T e -1641A/G da região promotora do gene PROC e os níveis plasmáticos de PC no grupo controlo. No que diz respeito aos doentes com sepsis, embora estes resultados ainda sejam preliminares e o estudo ainda esteja em curso, os genótipos CC/GG, TT/AA e CT/AG parecem estar associados a estadios de maior severidade de sepsis.
- Quantificação e caracterização fenotípica e funcional das células NK do sangue periférico em lúpus eritematoso sistémico (LES)Publication . Teixeira, Luís Filipe dos Santos, 1986-; Paiva, Artur Augusto; Teixeira, António José Martinho GomesIntrodução: O Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) é uma doença inflamatória crónica auto-imune que afecta múltiplos órgãos. A sua etiologia é multifactorial, em que a interacção entre factores genéticos, hormonais, ambientais e infecciosos leva à perda de tolerância imunológica e à produção de auto-anticorpos dirigidos principalmente contra antigénios nucleares, alguns dos quais participam nas lesões teciduais. As células NK através das suas capacidades citotóxicas e produção de citocinas inflamatórias podem influenciar as doenças auto-imunes. Objectivos: O objectivo deste estudo foi quantificar e analisar as características imunofenotípicas e funcionais das duas principais subpopulações de células NK nos pacientes com LES. Material e Métodos: Este estudo incidiu numa população de 44 indivíduos com diagnóstico de LES, dos quais 18 se encontravam na fase activa e 26 na fase inactiva da doença e em 30 indivíduos saudáveis, que constituíram o grupo controlo. Para este universo populacional, foi estudada a percentagem (%) e número absoluto de células NK, assim como das suas duas subpopulações, CD56dim e CD56bright, no sangue periférico e a frequência com que estes dois grupos celulares expressam o antigénio CD57 e o receptor de quimiocina CXCR3, e produzem interferon-gama (IFN- γ), factor de necrose tumoral-alfa (TNF- α), granzima B e perforina, assim como a quantidade de proteína por célula (MIF - média de intensidade de fluorescência), por citometria de fluxo. Resultados: Os resultados obtidos revelam uma clara diminuição dos números absolutos e relativos de células NK nos doentes com LES, principalmente naqueles com doença activa, enquanto que as proporções dos subtipos de células NK, não foram afectadas. Nos pacientes com LES activo encontrámos uma baixa densidade de CXCR3 em ambos os subtipos de células NK e uma baixa frequência de células NK CD56dim a expressar CXCR3. Para além disso, observámos que a expressão de granzima B nos dois grupos de doentes com LES está diminuída mas a percentagem de células NK a expressar granzima B e perforina está aumentada, especialmente na doença activa. Observou-se uma diminuição na percentagem de células NK CD56dim e CD56bright a produzir TNF- α e na sua expressão nas células NK CD56dim na doença activa, enquanto que a expressão de IFN- γ nas células NK CD56bright está aumentada em todos os pacientes com LES. Conclusão: Os nossos resultados sugerem que as células NK apresentam alterações funcionais e fenotípicas únicas, que são particularmente evidentes na doença activa, e podem afectar o desenvolvimento da doença.
- Transition from screen-film to computed radiography in a paediatric hospital: the missing link towards optimisationPublication . Paulo, Graciano; Santos, Joana; Moreira, Ana; Figueiredo, FilipaIn paediatrics, the risks associated with ionising radiation should be a major concern, due to children's higher susceptibility to radiation effects. Measure entrance skin dose (ESD) in chest and pelvis X-ray projections and compare the results with the 'European guidelines on quality criteria for diagnostic radiographer images in paediatrics' in order to optimise radiological practice. ESD values were obtained using an ionisation chamber Diamentor M4 KDK (PTW) in 429 children, who underwent chest X-ray or pelvis X-ray in a Computed Radiography system. In the first phase of the study, data were collected according to protocols used in the department; in a second phase different tube voltage values were used according to patient weight. A third phase was carried out, only for chest X-ray, using the exposure parameters of phase 2, plus activating lateral ionisation chamber. Three paediatric radiologists blindly assessed image quality of chest X-ray, using a validated assessment available in the 'European guidelines on quality criteria for diagnostic radiographer images in paediatrics'. Considering all the patients submitted to chest X-ray, the average ESD was 0.22, 0.16 and 0.08 mGy, for phases 1, 2 and 3, respectively. For pelvis X-ray, the average ESD decreased from 1.18 mGy in phase 1 to 0.78 mGy in phase 2. Dose optimisation was achieved. ESD was reduced 63.6 and 33.9 % in chest and pelvis X-ray, respectively.
- As características e funcionamento das conexinas, a surdez hereditária e a mutação do gene da conexina 26 e a displasia oculodentodigital e a mutação do gene da conexina 43Publication . Martins, Diana Mafalda Miranda, 1991-; Cruz, Andreia,; Girão, Cristina,
- Alterações genéticas em síndromes mielodisplásicos: definição da sequência de aparição de ditas alterações genéticas mediante técnica de FISH interfásica em diferentes compartimentos de células hematopoiéticas da medula ósseaPublication . Lopes, Catarina Isabel Amaral; Orfão, Alberto; Gabriel, António JoséAs síndromes mielodisplásicas (SMD) são um grupo de distúrbios clonais caracterizadas por uma hematopoiese ineficaz evoluindo 20-30% dos casos para Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA). São descritas diferentes alterações citogenéticas (del 5q, del 7q, -Y, del 20q e trissomia 8) em cerca de 50-60% dos pacientes com SMD primário e até 80% nos secundários, preponderantes para o desenvolvimento da patologia, bem como avaliação prognóstica, monitorização da resposta terapêutica e avaliação da sobrevida e risco de evolução para leucemia. Diferentes metodologias são utilizadas no estudo citogenético, nomeadamente a técnica de hibridização in situ de fluorescência (FISH) Interfásica, que apresenta uma maior sensibilidade e aplicabilidade. Foi objectivo desta tese de dissertação a identificação das alterações citogenéticas mais frequentes em cada linha celular estudada (células CD34+, neutrófilo, monócito, eritrócito, linfócito, basófilo, mastócito, eosinófilo e célula plasmática) bem como procurar estabelecer uma linha orientadora do ponto de vista da sequência de aparição das referidas alterações genéticas nos diferentes compartimentos celulares. Foram estudadas 42 amostras de medula óssea de doentes com SMD, dos quais 10 são CRDM, 11 são AREB-I, 15 são AREB-II, 4 são Síndromes mieloproliferativos SMP/SMD, uma amostra com displasia ligeira e uma amostra classificada como LMA secundária a SMD, sendo 5 do sexo feminino e 37 do sexo masculino. Efetuou-se uma separação celular por cell sorting das populações celulares de interesse e posteriormente realizou-se um protocolo de FISH para a identificação das dita alterações genéticas. Os resultados deste estudo sugerem uma incidência relativamente significativa das diferentes alterações citogenéticas nas distintas linhas celulares de cada amostra. De modo particular, são observados alguns casos que sugerem um aparecimento secundário das alterações citogenéticas estudadas ao longo da maturação celular. Nos casos de CRDM parece surgir inicialmente a delecção 5q e 7q e numa fase posterior a perda do cromossoma Y e a delecção 20q. Por sua vez, nos casos de AREB, parece surgir em primeiro lugar a delecção 7q seguida da delecção 5q e da trissomia 8, aparecendo raramente a perda do cromossoma Y e do 20q. Os resultados apontam para a ocorrência de alterações genéticas em mielodisplasia e em distintas linhas celulares com implicações ao nível do prognóstico, avaliação da resposta terapêutica e sobrevida dos doentes.
- TLD measurements and Monte Carlo simulations for glandular dose and scatter fraction assessment in mammography: a comparative studyPublication . Di Maria, Salvatore; Barros, Sílvia; Bento, Joana; Teles, Pedro; Figueira, Catarina; Pereira, Matheus; Vaz, P.; Paulo, GracianoThe main purpose of this study was to validate and compare Mean Glandular Dose (MGD) values obtained using Monte Carlo simulations with experimental values obtained from Entrance Surface Dose (ESD) and depth dose measurements performed in a Hospital mammography unit. ESD and depth dose were measured using ThermoLuminescent Dosimeters (TLDs), and a tissue equivalent mammography phantom recommended by the American College of Radiology (ACR). Measurements and Monte Carlo simulations were also compared with the MGD calculated using the Automatic Exposure Control (AEC) system of the mammographic unit. In the simulations the Doppler energy broadening effect was also taken into account. The simulated ESD are about 5%-10% higher than the measured ESD values. The deviation between the measured and simulated MGD values in the phantom is of about 15%. The MGD evaluated using the AEC system is smaller both with respect to the Monte Carlo simulation and experimental result by a factor of about 15% and 25% respectively. Moreover the BackScatter Factor (BSF) estimated by Monte Carlo simulations was used for the MGD calculation according to the Wu's method. Finally the inclusion of the energy broadening effect on MGD calculation produces negligible variations on the simulated results.