Browsing by Author "Domingos, Margarida"
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- ADN mitocondrial: Estudo de validação interna de metodologia de sequenciaçãoPublication . Domingos, Margarida; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Feiteiro, Mariana; Corte Real, Francisco; Amorim, AntónioEm genética forense, a sequenciação do ADN mitocondrial (ADNmt) pode ser uma ferramenta crucial designadamente sempre que não é possível obter ADN nuclear (ADNn) analisável, a partir das amostras biológicas. Amostras recolhidas em cadáveres em avançado estado de decomposição e cabelos ou pêlos recolhidos em local de crime são exemplos de amostras biológicas a partir das quais a análise do ADNmt pode ser o único meio de prova genético. O ADNmt é vantajoso por existir em maior quantidade do que o ADNn, mas tem a desvantagem de ser um elemento não individualizante, sendo comum a todos os indivíduos da mesma linhagem materna. O Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF), está a implementar a sequenciação massiva em paralelo (MPS), sequenciação de segunda geração. A MPS, relativamente à técnica de sequenciação de Sanger (SS), tem como vantagens, desde logo, permitir sequenciar o genoma mitocondrial completo e oferecer a capacidade de analisar múltiplas amostras biológicas em simultâneo. Com o objetivo de implementar e validar a sequenciação do genoma mitocondrial por MPS foi avaliada a concordância entre as metodologias SS e MPS. Foram selecionadas 64 amostras biológicas, previamente estudadas e analisadas pela metodologia SS. Para o estudo pela metodologia MPS as amostras foram extraídas com PrepFiler Express BTA™ Forensic DNA Extraction Kit e quantificadas com Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit. A preparação de bibliotecas de ADNmt foi feita num equipamento Ion Chef™ com o Precision ID mtDNA Whole Genome Panel e o Precision ID DL8 Kit. Na quantificação das bibliotecas de ADNmt foi utilizado o Ion Library TaqMan™ Quantitation Kit. A preparação do template e carregamento do Ion 530™ Chip foi realizada no Ion Chef™ com os kits Ion S5™ Precision ID Chef & Sequencing Kit. A sequenciação, através da deteção de alterações de pH provocada pela libertação de iões de hidrogénio (H+), ocorridas durante a polimerização do ADN e incorporação de bases, foi realizada num Ion GeneStudio™ S5 System e em conjunto com o sistema Ion Torrent™ que determinou a sequência da molécula em estudo, transformando o sinal químico em sinal digital. A análise e determinação do haplótipo do ADNmt foi realizada com o Converge™ Software. O haplótipo de ADNmt determinado com as metodologias SS e MPS foi coincidente em todas as amostras. Adicionalmente, a metodologia MPS aumentou a eficiência e precisão na análise das amostras de ADNmt. A simplicidade do sistema MPS elimina a necessidade de utilização de nucleotídeos modificados, de lasers, scanners e câmaras de deteção, garantindo exatidão na deteção dos polimorfismos. Este sistema garante ainda uma cobertura homogénea da sequência em estudo, até mesmo em regiões ricas em conteúdo GC e regiões homopoliméricas.
- Estudo comparativo e de validação de ensaios de quantificação de DNA, total e fração masculina, em amostras forenses, com diferentes metodologias e equipamentosPublication . Feiteiro, Mariana; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Domingos, Margarida; Cunha, Eugénia; Corte Real, Francisco; Amorim, AntónioA Genética Forense utiliza o DNA como o alvo de análise, sendo este um dos objetos de estudo mais importantes na análise forense, devido ao seu elevado potencial de individualização. A análise das amostras biológicas é realizada com o intuito de identificar o perfil genético dos vários envolventes, sendo que a quantidade de DNA presente nas mesmas pode variar consideravelmente, dependendo dos fatores a que estão expostas, o que poderá colocar em causa a obtenção do seu perfil genético. A quantificação do DNA no âmbito da Genética Forense tem um papel relevante para a obtenção de bons resultados, permitindo a análise da quantidade e qualidade do DNA presente numa amostra biológica, de forma a adaptar o restante protocolo para a obtenção de perfis genéticos ideais. A técnica de qPCR é considerada uma das mais precisas e sensíveis para quantificação de DNA, permitindo acompanhar em tempo real, ciclo a ciclo, o produto amplificado, através da alteração no sinal de fluorescência, detetado pelo termociclador. Para a implementação e utilização de um método é necessária a sua prévia validação, de forma a testar as suas capacidades e determinar vantagens e desvantagens do mesmo. No Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Sul (SGBF-S) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF), procedeu-se à validação interna de dois procedimentos de quantificação de DNA: os kits Quantifiler Trio e Investigator Quantiplex aplicados aos equipamentos QuantStudio 5 Real-Time PCR System for Human Identification e CFX Opus 96 Real-Time PCR System, respetivamente. Ambos os kits apresentam como alvos de amplificação duas regiões de DNA autossómico, uma large e uma small, e uma região alvo masculina. Relativamente aos equipamentos estudados, estes utilizam um conjunto de até 6 filtros associados a determinados corantes fluorescentes, que permitem a deteção de fluorescência na amostra, traduzindo-se na quantificação de DNA na mesma. A validação dos dois ensaios foi baseada no documento de validação interna do serviço, Procedimento Geral de Validação de Ensaios, dos quais foram testados, através de amostras controlo de concentração conhecida, diversos parâmetros: especificidade, sensibilidade, repetibilidade, reprodutibilidade e capacidade de diferenciação de misturas de material genético feminino e masculino, assim como a análise de amostras reais de forma a mimetizar a rotina laboratorial. Até ao momento, através dos estudos realizados, permite-se afirmar que ambos os ensaios são específicos para DNA humano e têm vindo a apresentar resultados semelhantes e esperados para os parâmetros em estudo. Contudo, constatou-se que não é possível a determinação do índice de degradação no ensaio do kit Investigator Quantiplex, devido à incompatibilidade na deteção do fluoróforo correspondente ao fragmento de DNA large, necessário para o cálculo do mesmo.