Browsing by Author "Alves, Miguel Ângelo da Costa"
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- Phenol stress response in Corynebacterium glutamicumPublication . Alves, Miguel Ângelo da Costa; Štěpánek, Václav; Santos, SóniaO principal objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos fatores Sigma A, Sigma C, Sigma E, Sigma H e um controlo (sem fator sigma) no promotor de Corynebacterium glutamicum. Procedeu-se à preparação dos promotores ParoF, Pcg1277, PcydA e PctaB, por associação de primers (PAROFPEPR Forward e PAROFPEPR Reverse, PCG1277PEPR Forward e PCG1277PEPR Reverse, PCYDAPEPR Forward e PCYDAPEPR Reverse, PCTABPEPR Forward e PCTABPEPR Reverse). Após este passo, seguiu-se a ligação, transformação e isolamento dos fragmentos obtidos. Seguidamente, foram preparadas as células competentes de C. glutamicum, em que os fatores sigma utilizados foram, Sigma A, Sigma C, Sigma E, Sigma H e uma estirpe sem fator sigma para funcionar como fator de controlo. Foi realizada a transformação em que se obtém o sistema de dois plasmídeos (pEC-XT99A e pEPR1) com os promotores construídos com a associação de primers e as estirpes com os diversos fatores sigma. Todas as transformações e preparações de células foram confirmadas por eletroforese em gel de agarose. Iniciaram-se os ensaios de fluorescência, que foram divididos em duas partes: no primeiro ensaio o meio de cultura continha apenas antibióticos, e no segundo ensaio houve adição de fenol ao meio de cultura. Em ambas as situações, existem estirpes com e sem IPTG, com e sem fenol, e com fenol e IPTG. No primeiro ensaio, confirmou-se que a presença dos promotores provoca uma alteração na expressão dos fatores sigma. Nomeadamente, a presença do promotor ParoF incita uma sobre expressão do Sigma H; o promotor Pcg1277 provoca uma sobre expressão do Sigma E e os promotores PcydA e PctaB, ambos incitam que o Sigma C tenha uma expressão acentuada. No segundo ensaio, com a adição de fenol, não houve diferenças nos fatores sigma que têm uma sobre-expressão devido à presença de determinados promotores, pois embora o fenol crie um ambiente tóxico na célula, com a presença de fenol houve expressão dos fatores sigma.