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Study of the effect of natural compounds and metal nanoparticles on microorganisms growing in suspension and biofilm
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Abstract(s)
O corrente trabalho, realizado na Vysoká Škola Chemicko-Technologická v Praze, teve como objetivo a investigação, estudo e desenvolvimento de uma sequência de métodos, de forma a avaliar a eficácia antimicrobiana, tanto em suspensão como em biofilme, de nano partículas de prata e ouro, em duas estirpes de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa DBM 3777 - PA 3777 e P. aeruginosa DBM 3081 - PA 3081). A P. aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, baciliforme e aeróbia, conhecida por ser um patogénico oportunista, resistente a um grande número de antibióticos e antissépticos. O estudo do seu crescimento em biofilme, definido como uma matriz biologicamente ativa de células microbianas contendo substâncias poliméricas extracelulares, tem especial relevância quando estas bactérias se podem proteger no interior do mesmo. Uma vez que estas estruturas podem aderir a diversas superfícies, protegendo as bactérias de ameaças externas, são de especial preocupação para hospitais, indústrias e famílias, para os quais implicam um risco elevado para a saúde.
As nanopartículas são partículas entre 1 e 100 nanómetros de diâmetro, com uma camada circundante interfacial e possuindo uma elevada área de contacto, o que as torna mais reativas a outras moléculas. Embora estejam associadas à indústria moderna, são usadas já há vários séculos e, presentemente, encontram-se presentes numa panóplia diversa de produtos e indústrias. O nível de toxicidade das nanopartículas depende das suas propriedades físico-químicas, composição e das espécies bacterianas. De facto, sabe-se que as nanopartículas afetam bactérias diversas, de diferentes maneiras e por mecanismos ainda desconhecidos, pelo que a pesquisa dos seus efeitos é ainda bastante atual.
No decurso deste estudo foi realizada, em primeiro lugar, uma análise ao crescimento em suspensão das duas espécies em estudo, para investigar a eficiência das nanopartículas. Para este efeito foi utilizada a densidade ótica (OD420-580nm) de uma suspensão que permite aferir da concentração de microrganismos no meio de crescimento. Os resultados obtidos foram de acordo com o esperado. As nano partículas de prata e ouro demonstraram a sua eficácia, reduzindo ou eliminando completamente a população bacteriana presente no meio de crescimento em função da sua concentração. Ainda dentro desta experiência, foi possível observar que a P. aeruginosa 3081 revelou ser mais resistente ao efeito tóxico de ambas as nanopartículas, do que a P. aeruginosa 3777.
Com estes primeiros resultados, comprovando as capacidades antimicrobianas das nanopartículas, foi possível avançar na investigação ao nível da formação do biofilme. Com este intuito foram realizados mais estudos complementares: determinação da concentração da biomassa no meio de crescimento após 24 horas (pela densidade ótica - OD a 600 nm) para efeitos de normalização de resultados, quantidade de indutores produzidos (pelo método de HSL), quantificação da formação de biofilme pelos métodos de confluência de células (CC) e cristal violeta (CV), e atividade metabólica (pelo método de MTT). Os dois primeiros estudos reportaram-se ao estudo no sobrenadante, e os últimos três no biofilme.
A concentração das nanopartículas usadas foi diferente para cada caso, uma vez que a prata mostrou ser mais eficiente do que o ouro, mesmo a concentrações mais baixas. Deste modo, as concentrações utilizadas para as nanopartículas de prata foram 0, 10, 20, 30, 40 e 50 mg / L e para as nanopartículas de ouro foram 0, 40, 50, 80, 120 e 140 mg / L. Foi ainda necessário efetuar uma correção, recorrendo ao fator de diluição, devido ao facto de a concentração inicial de P. aeruginosa ser diferente para cada ensaio.
O método de HSL permite estimar a quantidade de indutores produzidos pelas células face à toxidade induzida pelas nanopartículas, através da regulação da expressão de determinados genes, usando como biossensor a bactéria A. tumefaciens. Como resultado, foi possível observar que a estirpe PA 3777 produziu uma maior quantidade de indutores do que a PA 3081, quer em termos absolutos quer por biomassa suspensa. Verificou-se ainda uma maior produção de indutores em resultado da presença das nanopartículas de prata (para concentrações similares às de ouro). Contudo, a capacidade para aderir ao fundo dos poços, verificada pela biomassa aderida, foi similar para ambas as bactérias, sugerindo que o uso dos autoindutores testados não serve apenas para promover a adesão das bactérias.
A formação do biofilme foi estudada pelo método da confluência de células (CC), que determina a percentagem de área do poço ocupado por células aderidas e pelo método do cristal violeta (CV), que permite estimar o volume (ou massa) de biofilme aderido. Os resultados destes dois métodos apresentaram resultados divergentes no tocante à formação de biofilme pelas duas estirpes em estudo. Assim, enquanto que o método CC indiciou uma maior formação de área de biofilme por parte da estirpe PA 3081, o método CV indiciou o oposto, com a colorimetria a indicar uma forte tendência para a produção de uma quantidade maior de biofilme por parte da PA 3777. Saliente-se, contudo que as diferenças metodológicas entre estes dois métodos proporcionam este tipo de discordância entre os dois métodos. Por outro lado, e para ambas as estirpes, verificou-se um efeito maior na prevenção da formação de biofilme em resultado da presença das nanopartículas de prata (para concentrações similares às de ouro).
O método do MTT é um procedimento colorimétrico usado para aferir a atividade metabólica das células, baseando-se na conversão de MTT, em cristais de fomazano pelo sistema de desidrogenases das células vivas, permitindo avaliar, até um certo grau, viabilidade celular. Analisando os resultados obtidos, foi possível observar que a atividade metabólica, principalmente em termos absolutos foi superior para a estirpe PA 3777 do que para a estirpe PA 3081. Por outro lado, a ação das nanopartículas de prata (para concentrações similares às de ouro) revelou ser mais eficaz em termos da diminuição da atividade metabólica do biofilme em valores absolutos, mas menor quando normalizada pela biomassa aderida (em termos de CC).
Com os ensaios efetuados, foi possível, até certo ponto, comprovar a eficiência das nanopartículas sobre estas duas estirpes de P. aeruginosa. Os resultados neles obtidos, conjuntamente com a literatura apresentada, permitiram um estudo detalhado do efeito das nanopartículas de prata e de ouro, tanto em suspensão como em biofilme, corroborando a importância das nanopartículas para o mundo moderno e a razão pela qual se deve continuar a investir nesta área. Este trabalho pode ser aproveitado e desenvolvido de forma que a análise seja ainda mais completa, alargando o âmbito das experiências realizadas, incluindo a análise a outros microrganismos e diferentes nanopartículas.
Description
Keywords
Nano partículas Biofilme Pseudomonas aeruginosa Inibição de crescimento