Browsing by Author "Souza, Juliane Pereira de"
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- Clonagem e expressão de proteínas recombinantes humanas envolvidas em processos imunesPublication . Souza, Juliane Pereira de; Justino, MartaA expressão de proteínas recombinantes, em escala laboratorial, tem sido uma das aplicações mais visíveis da biotecnologia. A expressão heteróloga de proteínas depende da tecnologia do DNA recombinante, que, por meio da manipulação do material genético, permite a obtenção de quase todas as proteínas nas quantidades desejadas. Esta tese sobre clonagem e expressão de proteínas recombinantes humanas envolvidas em processos imunes apresenta o trabalho desenvolvido para clonar e expressar o Receptor 3 de Citotoxicidade Natural humano (NCR3), uma proteína de superfície expressa por células Natural Killer, um dos braços do sistema imunológico inato. Outro objetivo foi expressar também o ligante natural do NCR3, NCR3 Ligante 1 (NCR3LG1). Essas duas proteínas estão envolvidas na ativação da resposta inata do sistema imunológico contra proteínas tumorais que expressam NCR3LG1. Uma estratégia tradicional de amplificação por PCR baseada em primers foi utilizada para amplificar as regiões a serem clonadas dos genes de interesse de plasmídeos comerciais e cloná-los no vetor pET28a(+) para a expressão controlada das proteínas, com tag His6, por lac mediada pelo promotor T7 em células Escherichia coli BL21(DE3) Hi-ControlTM. O hNCR3 foi expresso com sucesso por indução com IPTG e foi recuperado dos corpúsculos de inclusão por purificação com refolding de proteína em coluna. O hNCR3LG1 foi expresso usando condições semelhantes, e foi recuperado do conteúdo celular por cromatografia de afinidade simples à base de níquel. Verificou-se que as proteínas produzidas estabelecem um complexo de 1: 1 in vitro, conforme determinado por uma abordagem simples de eletroforese em gel nativo, mantendo assim a funcionalidade desejada.