INMLCF - Comunicações Científicas e Pósteres
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Percorrer INMLCF - Comunicações Científicas e Pósteres por autor "Afonso Costa, Heloísa"
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- ADN antigo: pequenos passos, mas grandes avançosPublication . Correia Dias, Helena; Franco, Magda; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Figueiredo, Alexandra; Monteiro, Cláudio; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO estudo do DNA antigo (aDNA) será sempre uma fonte crucial de informação para a história das populações do passado e do futuro. Ao longo dos anos, o estudo do aDNA tem trazido vários obstáculos aos investigadores, os quais têm tentado novas abordagens para conseguir capturar material genético suficiente para as subsequentes análises. Com os diversos avanços tecnológicos, como a sequenciação genética next generation sequencing (NGS) ou massively parallel sequencing (MPS), novas oportunidades têm surgido. Não obstante, o processamento deste tipo de amostra será sempre desafiador devido às condições inerentes do aDNA, mas também certas condicionantes externas como a possível contaminação por ADN moderno ou contaminação laboratorial cruzada, armazenamento (nem sempre feito da forma mais adequada), ou certas condições ambientais, nas quais o material se encontrava antes de ser recuperado. O Laboratório de ADN Antigo do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses tem estudado remanescentes humanos no âmbito de um projeto colaborativo que abrange a investigação de comunidades de pré-história recente, na região centro de Portugal (MEDICE II). O objectivo desta apresentação consiste na explicação sumária do fluxo laboratorial envolvido no processamento de aDNA, e na apresentação de alguns dos resultados obtidos. No Laboratório de ADN Antigo, o processamento das amostras é feito em salas exclusivamente dedicadas para o efeito, e consiste, sumariamente, nos seguintes passos: 1) pré-tratamento da amostra (limpeza mecânica a baixa velocidade, minimizando o risco de degradação de ADN, e fragmentação/obtenção de pó); 2) extração automática de ADN; 3) quantificação de ADN; 4) sequenciação por MPS; 5) análise e interpretação de resultados. Seguindo o fluxo laboratorial descrito, observou-se, para a amostra em estudo, com cerca de 5000 anos, informações relevantes sobre a origem geográfica e o fenótipo do indivíduo. A análise estatística revelou uma percentagem maioritária para o grupo ancestral europeu e, relativamente ao fenótipo, observou-se que seria um indivíduo de olhos azuis, com uma tonalidade de cor de cabelo clara, e com uma coloração de pele intermédia. Não foi possível obter dados estatísticos para a cor do cabelo, nem informação relativa ao sexo. Passos pioneiros têm sido dados no caminho de expandir a investigação em aDNA e trazer novos avanços para a comunidade científica. Tendo em consideração as características particulares do aDNA, e também certos fatores extrínsecos, estes resultados são extremamente promissores. E, é precisamente por esse motivo, que o estudo do aDNA é uma das análises mais desafiadoras, mas também das mais estimulantes para os peritos forenses.
- ADN antigo: perspetivas e desafiosPublication . Correia Dias, Helena; Franco, Magda; Balsa, Filipa; Serra, Armando; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO DNA antigo (aDNA) pode ser uma fonte crucial de informação para estudos sobre a evolução e história das populações, revelando aspetos importantes, como migrações e interações humanas. Desde o primeiro estudo baseado no isolamento de aDNA, em 1984, novos desafios e oportunidades surgiram na área. Ao longo dos anos, com as melhorias técnicas nos métodos de extração de ADN e a emergência de novas metodologias de sequenciação de alto rendimento, como massive parallel sequencing, foram também impulsionadas novas perspetivas neste campo. Os restos humanos antigos, provenientes de escavações arqueológicas e de coleções museológicas, podem ser difíceis de analisar, principalmente devido à contaminação por ADN moderno, à degradação e exiguidade do aDNA, à contaminação laboratorial, ao armazenamento incorreto, às condições ambientais, entre outros. Além disso, apesar de muitos métodos de pré-tratamento terem sido propostos, poucos estudos relatam a preservação da estrutura e integridade do espécime. Os ossos e dentes são, muitas vezes, a única evidência da existência de um indivíduo ou população e devem ser analisados, mas essencialmente preservados. A análise de aDNA consiste, resumidamente, na preparação da amostra (usando, preferencialmente, um método não invasivo), extração de ADN, quantificação de ADN, PCR e sequenciação. O processo de preparação da amostra é determinante devido às características particulares do aDNA, como a baixa quantidade e a extensa degradação. Uma das questões mais importantes é a autenticidade do aDNA, sendo essencial minimizar o risco de contaminação por ADN moderno. Na extração de ADN, considerando amostras museológicas, é necessário selecionar um método não destrutivo, seguido de um método de quantificação preciso, que permita também otimizar a extração e detectar inibidores da PCR. A PCR deve também ter características específicas, comparando com a amplificação tradicional. Uma PCR dividida em dois passos é essencial para ultrapassar os artefactos do aDNA degradado. É aconselhável fazer múltiplas reações de PCR da mesma amostra e depois sequenciar as réplicas por sequenciação de Sanger. Após alinhamento e comparação das múltiplas sequências, a sequência de interesse é obtida. Recentemente, o Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Centro (SGBF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) criou um Laboratório de ADN Antigo com o objectivo principal de estudar amostras arqueológicas com diferentes intervalos post-mortem. Considerando que a análise de aDNA desempenha um papel crucial nos estudos arqueológicos e paleogenómicos, o objectivo da presente comunicação é divulgar e partilhar na comunidade científica o nosso novo Laboratório de ADN Antigo do INMLCF e mostrar o seu potencial para a expansão da investigação em aDNA, sendo que este laboratório está integrado num projecto científico que estuda comunidades da pré-história recente, na região centro de Portugal (MEDICE II).
- ADN mitocondrial: Estudo de validação interna de metodologia de sequenciaçãoPublication . Domingos, Margarida; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Feiteiro, Mariana; Corte Real, Francisco; Amorim, AntónioEm genética forense, a sequenciação do ADN mitocondrial (ADNmt) pode ser uma ferramenta crucial designadamente sempre que não é possível obter ADN nuclear (ADNn) analisável, a partir das amostras biológicas. Amostras recolhidas em cadáveres em avançado estado de decomposição e cabelos ou pêlos recolhidos em local de crime são exemplos de amostras biológicas a partir das quais a análise do ADNmt pode ser o único meio de prova genético. O ADNmt é vantajoso por existir em maior quantidade do que o ADNn, mas tem a desvantagem de ser um elemento não individualizante, sendo comum a todos os indivíduos da mesma linhagem materna. O Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF), está a implementar a sequenciação massiva em paralelo (MPS), sequenciação de segunda geração. A MPS, relativamente à técnica de sequenciação de Sanger (SS), tem como vantagens, desde logo, permitir sequenciar o genoma mitocondrial completo e oferecer a capacidade de analisar múltiplas amostras biológicas em simultâneo. Com o objetivo de implementar e validar a sequenciação do genoma mitocondrial por MPS foi avaliada a concordância entre as metodologias SS e MPS. Foram selecionadas 64 amostras biológicas, previamente estudadas e analisadas pela metodologia SS. Para o estudo pela metodologia MPS as amostras foram extraídas com PrepFiler Express BTA™ Forensic DNA Extraction Kit e quantificadas com Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit. A preparação de bibliotecas de ADNmt foi feita num equipamento Ion Chef™ com o Precision ID mtDNA Whole Genome Panel e o Precision ID DL8 Kit. Na quantificação das bibliotecas de ADNmt foi utilizado o Ion Library TaqMan™ Quantitation Kit. A preparação do template e carregamento do Ion 530™ Chip foi realizada no Ion Chef™ com os kits Ion S5™ Precision ID Chef & Sequencing Kit. A sequenciação, através da deteção de alterações de pH provocada pela libertação de iões de hidrogénio (H+), ocorridas durante a polimerização do ADN e incorporação de bases, foi realizada num Ion GeneStudio™ S5 System e em conjunto com o sistema Ion Torrent™ que determinou a sequência da molécula em estudo, transformando o sinal químico em sinal digital. A análise e determinação do haplótipo do ADNmt foi realizada com o Converge™ Software. O haplótipo de ADNmt determinado com as metodologias SS e MPS foi coincidente em todas as amostras. Adicionalmente, a metodologia MPS aumentou a eficiência e precisão na análise das amostras de ADNmt. A simplicidade do sistema MPS elimina a necessidade de utilização de nucleotídeos modificados, de lasers, scanners e câmaras de deteção, garantindo exatidão na deteção dos polimorfismos. Este sistema garante ainda uma cobertura homogénea da sequência em estudo, até mesmo em regiões ricas em conteúdo GC e regiões homopoliméricas.
- Análise comparativa de métodos de extração de ADN antigo em amostras ósseas e dentárias em contexto forense: Revisão da literaturaPublication . Henriques, Madalena; Afonso Costa, Heloísa; Cainé, Laura; Amorim, AntónioO estudo do ADN antigo baseia-se em estratégias metodologicamente inovadoras e cumulativas, que visam a reconstrução genética de populações passadas a partir de fragmentos ósseos humanos com intervalos post mortem que variam entre centenas e milhares de anos. O procedimento laboratorial envolve etapas como a limpeza e fragmentação das amostras ósseas e dentárias, a extração, quantificação, amplificação, sequenciação e análise bioinformática do ADN. A ausência de um protocolo universal para a extração de ADN antigo implica a necessidade de seleção criteriosa do método mais eficaz, de acordo com o contexto da investigação e propriedades da amostra. Neste trabalho, destaca-se a importância da escolha do método de extração como um fator determinante para a obtenção de ADN endógeno em quantidade suficiente e livre de inibidores, permitindo a obtenção de perfis genéticos ou sequências de ADN o mais completos possíveis. O objetivo principal deste trabalho consiste na análise comparativa de diferentes métodos de extração de ADN antigo, com base numa revisão da literatura científica. Os métodos mais frequentemente utilizados incluem métodos orgânicos, de entre os quais o método fenol-clorofórmio, o mais utilizado e que, apesar de laborioso, parece permitir a obtenção de boas quantidades de ADN extraído. Outro conjunto de métodos inclui a utilização de sílica, quer em suspensão, quer em coluna, e que tem um papel importante na fase de separação e purificação do ADN. Para aplicações forenses, têm sido desenvolvidos métodos comerciais, como PrepFiler Express BTA, NucleoSpin DNA Forensic e QIAamp DNA Investigator Kit. Os métodos à base de sílica são geralmente preferidos, embora a utilização de reagentes como DTT e PTB possa diminuir a quantidade de ADN extraído, dado que dificultam a lise proteica ou não promovem a desintegração completa de determinadas moléculas. Uma solução vantajosa parece ser a combinação dos métodos orgânicos e comerciais, permitindo maximizar a quantidade e qualidade do ADN extraído, com vista à definição de um perfil ou sequência consenso. Apesar dos avanços tecnológicos, a degradação e a contaminação continuam a ser dos principais desafios na extração de ADN antigo. A avaliação da eficácia da extração pode ser realizada com base em parâmetros obtidos pela quantificação. De forma a otimizar os recursos, protocolos semi-automatizados podem reduzir os custos e o tempo de análise. Para um melhor entendimento das limitações atuais e aperfeiçoamento das técnicas existentes, torna-se essencial o estudo de diferentes amostras, com origens e tipologias de material ósseo e dentário diversificadas. Ainda que a escolha metodológica deva ser adaptada aos objetivos específicos de cada estudo, a utilização de diretrizes é fundamental para assegurar a comparabilidade interlaboratorial. Neste contexto, revisões de literatura como a presente assumem um papel relevante na orientação de futuras inovações e aplicações na área forense.
- Aplicação forense de marcadores genéticos de ancestralidade biogeográfica e características visíveis externamente: interpretação e relatório pericialPublication . Afonso Costa, Heloísa; Amorim, António; Nascimento, Rui; Cainé, Laura; Cunha, Eugénia; Corte Real, FranciscoA capacidade de multiplexação da sequenciação massiva em paralelo (MPS), em simultâneo com a capacidade de análise de diversos tipos de marcadores genéticos, conduziu a genética forense a uma utilização mais frequente dos polimorfismos de nucleotído único (SNPs). Iniciaram-se, também, as análises denominadas Forensic DNA Phenotyping (FDP) que incluem a inferência da ancestralidade biogeográfica (BGA) e a inferência das características visíveis externamente (EVC) a partir de uma amostra biológica. Características que poderão orientar a investigação e a pesquisa em registos, dotando o ADN da capacidade de atuar como testemunha. No entanto, a interpretação de genótipos e haplótipos de BGA pode ser desafiadora, faltando ainda, orientações e harmonização sobretudo sobre a forma de expor os resultados obtidos. Este trabalho tem como objetivos apresentar o método desenvolvido no Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Sul (SBGF-S) para a determinação dos marcadores BGA e EVC; e apresentar um modelo de relatório pericial que pretende explanar os procedimentos a que a amostra foi submetida e traduzir os resultados em conclusões adequadas e percetíveis. Foram analisadas amostras colhidas após consentimento informado livre e esclarecido aprovado pela comissão ética e científica do INMLCF. As amostras foram extraídas com PrepFiler Express BTA™ Forensic DNA Extraction Kit e quantificadas com Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit. A preparação de bibliotecas de 41 SNPs autossómicos informativos para a EVC, 163 SNPs autossómicos de ancestralidade, e 116 Y-SNPs específicos de linhagem paterna incluídos no Ion AmpliSeq™ PhenoTrivium Panel, foi realizada de forma manual. A preparação de bibliotecas de ADN mitocondrial (ADNmt) foi realizada num equipamento Ion Chef™ com o Precision ID mtDNA Whole Genome Panel. A preparação do template e carregamento do Ion 530™ Chip foi realizada num Ion Chef™ utilizando o Ion S5™ Precision ID Chef & Sequencing Kit. A sequenciação foi realizada num Ion GeneStudio™ S5 System. A análise primária da sequência detetada foi realizada no Servidor Torrent em relação ao genoma de referência, hg19. A tipagem genética foi realizada utilizando o plugin HIDGenotyper-2.2 e a previsão BGA foi determinada com o Converge™ Software, baseada num método de bootstrap e um intervalo de confiança de 95%. A população de referência utilizada, compreende sete populações da base de dados ALFRED: África, América, Leste Asiático, Europa, Oceânia, Sul da Ásia e Sudoeste Asiático. A ancestralidade paterna e materna foi determinada recorrendo ao software YLeaf e à base de dados EMPOP, respetivamente. A predição do fenótipo foi obtida usando o Erasmus HPS Webtool. O conjunto dos SNPs autossómicos de ancestralidade, SNPs específicos de linhagem paterna e materna, e SNPs autossómicos fenotípicos, escolhidos, mostraram-se adequados para a determinação da BGA e EVC de uma amostra desconhecida, tendo sido elaborado o relatório pericial modelo.
- Body fluid identification and donor association of mock case samples: Results of two EDNAP collaborative exercisesPublication . Hänggi, Nadescha; Amorim, António; Afonso Costa, Heloísa; D. Andersen, Jeppe; Morling, Niels; Kampmann, Marie-Louise; Courts, Cornelius; Gosch, Annica; Neis, Maximilian; Syndercombe Court, Denise; Giangasparo, Federica; Elida Fonneløp, Ane; Johannessen, Helen; Hadrys, Thorsten; Parson, Walther; Niederstätter, Harald; Sidstedt, Maja; Sijen, Titia; van den Berge, Margreet; Hanson, Erin; Ballantyne, Jack; Haas, CordulaThe European DNA Profiling Group (EDNAP) has previously evaluated the performance, robustness, and reproducibility of various mRNA markers for identifying body fluids using capillary electrophoresis (CE) and massively parallel sequencing (MPS) methods. MPS of mRNA targets is used for body fluid identification and provides information on who contributed which body fluid to a binary mixture, thereby adding important contextual aspects to a crime scene investigation. The analysis of coding region SNPs (cSNPs) in body fluid-specific transcripts allows the association of an individual’s DNA cSNP profile with the body fluid-specific RNA cSNP genotype. The Zurich Institute of Forensic Medicine in Switzerland organized two consecutive collaborative exercises within the EDNAP group to evaluate the performance of two targeted mRNA sequencing assays: the BSS cSNP assay (for blood, saliva, and semen) and the 6F cSNP assay (for six fluids/tissues, including BSS and additionally vaginal secretion, menstrual blood, and skin). Each cSNP RNA assay was accompanied by a genomic DNA assay to genotype the cSNPs in the person(s) of interest. Eleven laboratories participated in one or both of the EDNAP collaborative exercises. In each exercise, 16 mock case samples were provided by the organizers, and the laboratories could analyze additional, self-prepared stains. Participants could use either the Ion S5 or the MiSeq sequencing platform. Here, we present the compiled results of the two collaborative exercises. We investigated DNA and RNA yields, STR profiles, and RNA profiles for body fluid identification and body fluid - donor association. While the mock case samples provided information on the performance of the assays, the self-prepared stains were a blind test for the organizers to identify the body fluids and the contributors.
- Caracterização genética dos imigrantes oriundos de Brasil, Cabo Verde, Angola, Moçambique e Guiné Bissau. Impacto da miscigenação na genética forensePublication . Marcelino, Miguel; Afonso Costa, Heloísa; Correia Dias, Helena; Corte-Real, Francisco; Amorim, AntónioPortugal recebeu um grande influxo de imigrantes oriundos de diversos países. Dentro destes destacam-se aqueles vindos de países pertencentes à Comunidade dos Países de Língua Portuguesa (CPLP). Em 2022 contabilizaram-se cerca de 350 000 imigrantes oriundos destes países, aproximadamente 45% do número total de imigrantes a residir em Portugal. A introdução destas populações imigrantes acrescenta variabilidade genética à população portuguesa pela introdução de variantes genéticas características de populações africanas e sulamericanas. Este facto deve ser avaliado para que na valorização das perícias de genética e biologia forenses a população de referência seja a mais representativa da realidade e se possa alcançar o valor de probabilidade mais correto. A valorização quantitativa da prova biológica é feita, calculando a razão da verossimilhança, Likelihood Ratio (LR). O LR é a razão de duas probabilidades condicionais, que indica o número de vezes que é mais provável a ocorrência dos perfis genéticos determinados admitindo a Hipótese 1 como verdadeira - o indivíduo é o contribuidor -, relativamente à ocorrência desses mesmos perfis admitindo a Hipótese 2 como verdadeira - um indivíduo ao acaso da população de referência é o contribuidor. É então necessário o conhecimento prévio das frequências alélicas, genéticas e haplotípicas da população de referência. A escolha da população de referência pode ser particularmente problemática nas perícias que envolvem imigrantes, já que não é óbvio qual a melhor população de referência a ser utilizada, se a do seu país de origem, se a do local onde está atualmente a residir, ou se a população de referência onde se deu a ocorrência (crime, desaparecimento, procriação). As populações de imigrantes a residir em Lisboa foram sendo estudadas desde 2012 no âmbito do projecto de investigação "A população de Lisboa do início do século XXI: caracterização genética dos novos habitantes oriundos do Brasil, Cabo Verde, Angola e Guiné Bissau". Foram determinadas as frequências alélicas de marcadores genéticos autossómicos, particularmente os da European Standard Set (ESS) e do Combined DNA Index System (CODIS). Foram determinadas as frequências alélicas de marcadores genéticos do cromossoma X, as frequências haplotípicas de marcadores genéticos do cromossoma Y e frequências haplotípicas da região controlo do ADN mitocondrial. Relativamente e mais particularmente ao estudo do ADN mitocondrial verificou-se que estes imigrantes apresentam maioritariamente haplótipos pertencentes a haplogrupos tipicamente africanos e sul-americanos. É importante considerar que a miscigenação contínua entre diferentes grupos étnicos gera uma maior diversidade genética sendo necessária a constante atualização das bases de dados referentes às populações de referência para garantir uma representação precisa e fornecer uma valorização da prova biológica consentânea com a realidade populacional.
- Codis and the Portuguese DNA Database: Novel intersections between Biology, Medicine, Informatics, Mathematics, Engineering and LawPublication . Amorim, António; Afonso Costa, Heloísa; Gomes, Paulo Ferreira; Corte Real Gonçalves, FranciscoAt the scope of criminal and forensic investigations, the criminal authorities, health professionals, and many other intervenients can obtain different kinds of samples with biological material. The study of those samples by DNA laboratories can lead to the achievement of genetic profiles. CODIS and similar informatic DNA databases, by storing and managing those genetic profiles, can aid at criminal investigation by linking perpetrators to biological evidence samples. The same way CODIS can aid at human civil identification by linking relatives of missing persons to biological evidence samples. Thus, these novel intersections between biology, medicine, informatics, mathematics, engineering and law can lead to the resolutions of different kinds of crimes as well as other forensic matters such as human civil identification or clarification of kinship relations.
- Cronómetros do Esqueleto: a metilação de ADN como o novo método da estimativa da idade para remanescentes humanos esqueletizados.Publication . Silva, João; Correia Dias, Helena; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Corte Real, Francisco; Cainé, Laura; Amorim, AntónioNos últimos anos, a análise da metilação do ADN (DNAm) surgiu como uma ferramenta promissora para a estimativa da idade à morte do indivíduo, em contexto médico-legal e forense. Em situações mais complexas que envolvem remanescentes humanos esqueletizados não identificados, a estimativa da idade à morte é um pilar essencial, ajudando na identificação, mas também no redireccionamento da investigação forense e criminal. Este estudo tem como objetivo aplicar em remanescentes mortais esqueletizados de indivíduos da população portuguesa, o modelo de predição de idade (age prediction model, APM), originalmente desenvolvido em ossos frescos de indivíduos portugueses por Correia Dias et al. (2020). Com este trabalho pretendemos impulsionar o desenvolvimento de novas metodologias para a estimativa da idade em material esquelético mais comprometido, em contexto médico-legal e forense. Uma vez que os ossos são frequentemente o único material biológico disponível em situações em que a morte não tenha sido recente, a estimativa de idade baseada nos níveis de DNAm capturados em ossos oferece vantagens distintas sobre as abordagens morfológicas tradicionais quando os restos mortais estão altamente degradados ou incompletos. Este estudo centra-se na análise dos padrões de DNAm dos genes C1orf132, EDARADD e ELOVL2, que têm mostrado, consistentemente, fortes correlações com a idade cronológica em vários tecidos, incluindo ossos. Dados os desafios inerentes ao ADN degradado em amostras de ossos secos, este projeto desenvolveu e otimizou um protocolo que inclui várias extrações de ADN por amostra e uma etapa de concentração subsequente para maximizar o rendimento e a qualidade do ADN. O ADN foi extraído usando o kit PrepFiler Express BTATM, quantificado com o kit QuantifilerTM Trio e concentrado através de dispositivos de filtro centrífugo Microcon®. A conversão de bissulfito foi efetuada com o kit EZ ADN Methylation-GoldTM, permitindo uma avaliação precisa dos níveis de DNAm nos locais CpG alvo. A fase experimental do projeto envolveu a análise de amostras de ossos de casos do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF) de 2017 a 2021. Após a extração, quantificação e concentração do ADN, o ADN foi convertido através de bissulfito de sódio e submetido à amplificação por PCR e sequenciação de Sanger para avaliar a DNAm nos CpGs alvo. A correlação entre os níveis de DNAm e a idade cronológica dos indivíduos será analisada estatisticamente com o software IBM SPSS, v.27, usando modelos de regressão linear. O APM tecido-específico previamente desenvolvido em ossos de cadáveres frescos (Correia Dias et al., 2020) será aplicado a ossos de casos forenses do INMLCF. Espera-se que os resultados contribuam para o desenvolvimento de protocolos normalizados estimulando a investigação futura sobre aplicações forenses baseadas na análise da DNAm. Acredita-se que os avanços no domínio da epigenética forense possam apoiar a resolução de casos forenses complexos.
- Estudo comparativo e de validação de ensaios de quantificação de DNA, total e fração masculina, em amostras forenses, com diferentes metodologias e equipamentosPublication . Feiteiro, Mariana; Afonso Costa, Heloísa; Nascimento, Rui; Domingos, Margarida; Cunha, Eugénia; Corte Real, Francisco; Amorim, AntónioA Genética Forense utiliza o DNA como o alvo de análise, sendo este um dos objetos de estudo mais importantes na análise forense, devido ao seu elevado potencial de individualização. A análise das amostras biológicas é realizada com o intuito de identificar o perfil genético dos vários envolventes, sendo que a quantidade de DNA presente nas mesmas pode variar consideravelmente, dependendo dos fatores a que estão expostas, o que poderá colocar em causa a obtenção do seu perfil genético. A quantificação do DNA no âmbito da Genética Forense tem um papel relevante para a obtenção de bons resultados, permitindo a análise da quantidade e qualidade do DNA presente numa amostra biológica, de forma a adaptar o restante protocolo para a obtenção de perfis genéticos ideais. A técnica de qPCR é considerada uma das mais precisas e sensíveis para quantificação de DNA, permitindo acompanhar em tempo real, ciclo a ciclo, o produto amplificado, através da alteração no sinal de fluorescência, detetado pelo termociclador. Para a implementação e utilização de um método é necessária a sua prévia validação, de forma a testar as suas capacidades e determinar vantagens e desvantagens do mesmo. No Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Sul (SGBF-S) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF), procedeu-se à validação interna de dois procedimentos de quantificação de DNA: os kits Quantifiler Trio e Investigator Quantiplex aplicados aos equipamentos QuantStudio 5 Real-Time PCR System for Human Identification e CFX Opus 96 Real-Time PCR System, respetivamente. Ambos os kits apresentam como alvos de amplificação duas regiões de DNA autossómico, uma large e uma small, e uma região alvo masculina. Relativamente aos equipamentos estudados, estes utilizam um conjunto de até 6 filtros associados a determinados corantes fluorescentes, que permitem a deteção de fluorescência na amostra, traduzindo-se na quantificação de DNA na mesma. A validação dos dois ensaios foi baseada no documento de validação interna do serviço, Procedimento Geral de Validação de Ensaios, dos quais foram testados, através de amostras controlo de concentração conhecida, diversos parâmetros: especificidade, sensibilidade, repetibilidade, reprodutibilidade e capacidade de diferenciação de misturas de material genético feminino e masculino, assim como a análise de amostras reais de forma a mimetizar a rotina laboratorial. Até ao momento, através dos estudos realizados, permite-se afirmar que ambos os ensaios são específicos para DNA humano e têm vindo a apresentar resultados semelhantes e esperados para os parâmetros em estudo. Contudo, constatou-se que não é possível a determinação do índice de degradação no ensaio do kit Investigator Quantiplex, devido à incompatibilidade na deteção do fluoróforo correspondente ao fragmento de DNA large, necessário para o cálculo do mesmo.